密度梯度離心法分離PBMC原理及實驗步驟
從外周血、骨髓、外周淋巴器官或各種組織分離出來的細(xì)胞是多種細(xì)胞的混合物。如要研究某種特定細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能或表面標(biāo)志等特征，首先要分離純化細(xì)胞。細(xì)胞分離可根據(jù)其大小、密度、表面電荷、吸附能力或表面抗原的差異而采用密度梯度沉降法、貼附、親和層析、化環(huán)形成、補體介導(dǎo)殺傷溶解、免疫磁珠以及流式細(xì)胞儀（FCM）等方法來進(jìn)行純化。
一．Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC原理
常用來分離人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的分層液比重是1.077 ± 0.001 kg/L的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografn）（F /H）分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，親水性高，平均分子量為400000。當(dāng)密度為1.2 g/ml仍未超出止常生理性滲透壓，也不透過生物膜。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分層液中，吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個核細(xì)胞。
圖1 PBMC分離示意圖
二．PBMC分離的實驗步驟
1.在短中管中加入適量淋巴細(xì)胞分離液。
2.取肝素抗凝靜脈血與等量Hanks液或RPMI1640液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2 000 rpm，20 min。
3.離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank's液、下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一處以單個核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有血小板。
4.用彎頭滴管插到云霧層，仔細(xì)吸取單個核細(xì)胞；也可采用先吸棄上層RPMI 1640和血漿，然后收集富含PBMC的云霧層。將云霧層細(xì)胞置人另一短中管中，加人5倍以上體積的Hank's液或RPMI 1640，1500 rpm離心10min，洗滌細(xì)胞兩次。
5.末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI 1640，重懸細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液與一滴0.2%臺盼蘭染液混合，于血球計數(shù)板上，計數(shù)四個大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。單個核細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/1ml細(xì)胞懸液）=4個大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)/4×104×2（稀釋倍數(shù)）。
6.細(xì)胞活力檢測：死的細(xì)胞可被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。計數(shù)200個淋巴細(xì)胞。計算出活細(xì)胞百分率�；罴�(xì)胞百分率（%）=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。
7.細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml培養(yǎng)基，加于六孔板或24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。
8.細(xì)胞收集：將六孔板或二十四孔板中的培養(yǎng)基吸出棄掉，每孔加200µL Trizol，用移液槍將孔壁吹打數(shù)次后，將Trizol轉(zhuǎn)入EP管中。
9.細(xì)胞凍存：將收集的細(xì)胞放入-80℃冰箱中保存。
三．實驗過程中的注意事項
1. Ficoll應(yīng)適量，外周血應(yīng)充分稀釋。
2. 溫度直接影響到Ficoll的比重和分離效果。
3. 在Ficoll上加入稀釋后的外周血時，應(yīng)緩慢加，以免沖散界面。
4. 吸取單個核細(xì)胞層時，應(yīng)避免吸出過多的上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染。
四．羊駝PBMC產(chǎn)品優(yōu)勢
1. 細(xì)胞活率高：實驗中使用的分離試劑無菌、低內(nèi)毒素，對細(xì)胞無傷害刺激，操作人員具備多年P(guān)BMC細(xì)胞分離經(jīng)驗，最大程度保證細(xì)胞的原始狀態(tài)，分離后的新鮮細(xì)胞或凍存復(fù)蘇后的活率可達(dá)90%以上。
2. 產(chǎn)品安全性高、無傳染源：嚴(yán)格把控羊駝/駱駝全血來源，保證實驗駱駝均經(jīng)過相關(guān)傳染源檢測，為客戶提供更安全、更放心的實驗材料。
3. 細(xì)胞來源清晰、可溯源：分離羊駝/駱駝使用的全血均由正規(guī)動物中心提供采集，具備完全合規(guī)的采購流程以及全血生物安全證書，免除客戶使用的后顧之憂。
泰克生物具有成熟的動物PBMC分離技術(shù)，保證細(xì)胞分離過程中不受損害、不被刺激，后期的純化技術(shù)保證駱駝單個核細(xì)胞的純度以及活率等技術(shù)指標(biāo)，適用于后期的細(xì)胞培養(yǎng)、抗體制備等其他研究。
