轉(zhuǎn)染的分類、應(yīng)用場(chǎng)景、實(shí)驗(yàn)步驟及細(xì)胞類型介紹

一、引言

轉(zhuǎn)染是分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的重要技術(shù)，它允許我們向細(xì)胞引入外源基因，從而進(jìn)行基因功能研究、基因表達(dá)調(diào)控，或是進(jìn)行基因治療等。本文將詳細(xì)介紹轉(zhuǎn)染的概念、分類、應(yīng)用場(chǎng)景、步驟，常用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型、以及大家常用試劑等方面來(lái)介紹此技術(shù)。

 

二、轉(zhuǎn)染概念

轉(zhuǎn)染，顧名思義，是指將某種物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)。在生物醫(yī)學(xué)研究中，這個(gè)“物質(zhì)”通常指的是DNA或RNA。通過(guò)轉(zhuǎn)染，我們可以向細(xì)胞引入新的基因，或者沉默或敲低細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)基因，從而研究該基因?qū)��?xì)胞生命活動(dòng)的影響。

 

三、轉(zhuǎn)染的分類

根據(jù)轉(zhuǎn)染物質(zhì)的種類，轉(zhuǎn)染可分為DNA轉(zhuǎn)染和RNA轉(zhuǎn)染。

DNA轉(zhuǎn)染是指將外源DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程，它是真核細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程。通常用于基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成的研究。

而RNA轉(zhuǎn)染指將RNA分子導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程，則主要用于干擾RNA的研究，以探究特定基因的功能。

根據(jù)轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性和效率，轉(zhuǎn)染又可以分為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源基因（DNA/RNA）整合到宿主基因組上，并能穩(wěn)定遺傳給后代，這多用于長(zhǎng)期觀察基因?qū)τ诩?xì)胞功能的影響以及蛋白之間的相互作用。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染則是指外源基因（DNA/RNA）不整合到宿主基因組上，僅在細(xì)胞分裂周期內(nèi)表達(dá)，主要用于啟動(dòng)子和其他調(diào)控原件的分析以及蛋白質(zhì)的功能研究。

兩者的實(shí)驗(yàn)步驟相似，但在實(shí)驗(yàn)操作上有一定的差異。

首先，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所使用的轉(zhuǎn)染試劑不同。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通常使用脂質(zhì)體等試劑，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源基因整合到細(xì)胞基因組中。這些試劑可以促進(jìn)外源基因與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染則是使用聚凝胺等試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，雖然這些試劑也可以促進(jìn)外源基因進(jìn)入細(xì)胞，但它們不會(huì)將基因整合到細(xì)胞基因組中。

其次，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)外源基因的要求也不同。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通常需要使用具有復(fù)制能力的質(zhì)粒或病毒載體，以便外源基因可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并整合到細(xì)胞基因組中。而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染則不需要使用具有復(fù)制能力的載體，因?yàn)橥庠椿�因只是短暫地表達(dá)，拷貝數(shù)會(huì)被稀釋，無(wú)法達(dá)到持續(xù)表達(dá)外源基因的目的。

根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的不同，可分為：化學(xué)轉(zhuǎn)染、物理轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)染。

化學(xué)轉(zhuǎn)染：通過(guò)使用一些化學(xué)物質(zhì)，如聚乙烯亞胺（PEI）、脂質(zhì)體等，來(lái)改變細(xì)胞膜的物理和化學(xué)性質(zhì)，使其對(duì)外源性DNA或RNA具有親和力，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以通過(guò)控制化學(xué)物質(zhì)的濃度和作用時(shí)間等因素來(lái)精確控制轉(zhuǎn)染的效率和時(shí)間。

物理轉(zhuǎn)染：包括基因槍法和電擊法。基因槍法利用高速運(yùn)動(dòng)的粒子，將DNA或RNA撞擊到細(xì)胞膜上，從而進(jìn)入細(xì)胞。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入（實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大）。物理轉(zhuǎn)染的優(yōu)點(diǎn)在于可以直接將DNA或RNA導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，而不需要使用任何化學(xué)物質(zhì)。

病毒轉(zhuǎn)染：利用病毒作為載體，將外源基因包裝后導(dǎo)入細(xì)胞。這種方法可以有效地實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定整合和表達(dá)，同時(shí)具有較高的轉(zhuǎn)染效率和安全性。常用的病毒載體包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。病毒轉(zhuǎn)染的優(yōu)點(diǎn)在于可以實(shí)現(xiàn)高效、特異性的基因轉(zhuǎn)移，同時(shí)避免使用某些化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的負(fù)面影響。

 

四、轉(zhuǎn)染應(yīng)用場(chǎng)景

1.在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，轉(zhuǎn)染技術(shù)的主要應(yīng)用包括：

基因功能研究：通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源基因?qū)�入�?xì)胞，研究該基因在細(xì)胞中的功能、表達(dá)調(diào)控、亞細(xì)胞定位等。

基因敲除和沉默：通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入含有特定基因敲除或沉默序列的質(zhì)粒，研究特定基因的敲除或沉默對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等的影響。

病毒感染研究：將病毒基因?qū)�入�?xì)胞系，研究病毒感染細(xì)胞的機(jī)制、抗病毒藥物的作用機(jī)理等。

細(xì)胞分化和命運(yùn)決定：通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入與細(xì)胞分化命運(yùn)相關(guān)的基因或調(diào)控元件，研究細(xì)胞的分化、凋亡、自噬等過(guò)程。

腫瘤研究：將與腫瘤相關(guān)的基因?qū)�入腫瘤細(xì)胞系，研究腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤耐藥性、腫瘤免疫等。

 

2.在藥物研發(fā)和生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)染技術(shù)的主要應(yīng)用包括：

疫苗生產(chǎn)：將病毒抗原基因?qū)�入合適的細(xì)胞系，通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得可表達(dá)病毒抗原的細(xì)胞系，用于制備疫苗。例如，將病毒抗原基因?qū)�入昆蟲(chóng)細(xì)胞中，可以生產(chǎn)出高效、安全的病毒疫苗。

基因治療：將治療性基因（如治療性siRNA、質(zhì)粒DNA等）導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因治療。例如，將特定基因?qū)�入心肌�?xì)胞中，可以治療遺傳性心臟病或心肌梗死等疾病。

藥物篩選：通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)將藥物靶點(diǎn)基因?qū)�入�?xì)胞系，用于篩選能夠與藥物靶點(diǎn)結(jié)合的藥物候選物。

生產(chǎn)細(xì)胞系：在生產(chǎn)重組蛋白藥物、抗體藥物等過(guò)程中，通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)將目的基因?qū)�入生產(chǎn)細(xì)胞系，獲得可穩(wěn)定表達(dá)目的藥物的細(xì)胞系。

總之，轉(zhuǎn)染技術(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域和藥物研發(fā)、新藥開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，為研究基因功能、疾病治療和新藥開(kāi)發(fā)提供了有效的工具和方法。

 

五、轉(zhuǎn)染步驟

1.以下是較為常見(jiàn)的一種轉(zhuǎn)染方法的步驟：

 

☆ 準(zhǔn)備細(xì)胞：選擇適當(dāng)類型的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染前進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)，確保細(xì)胞處于對(duì)轉(zhuǎn)染最有利的狀態(tài)。

☆ 準(zhǔn)備基因：將目的基因以合適的方式進(jìn)行剪切和標(biāo)記，以便于后續(xù)的檢測(cè)和篩選。

☆ 制備轉(zhuǎn)染載體：選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染載體，如脂質(zhì)體、病毒等，將目的基因包裹在轉(zhuǎn)染載體中（這個(gè)步驟是載體構(gòu)建，將目的基因插入到轉(zhuǎn)染載體中，形成重組目的基因片段，并利用這種重組片段轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，從而將目的基因?qū)�入�?xì)胞中）

☆ 進(jìn)行轉(zhuǎn)染：按照生產(chǎn)商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，將轉(zhuǎn)染載體導(dǎo)入受體細(xì)胞。

☆ 確認(rèn)轉(zhuǎn)染效果：通過(guò)特定的檢測(cè)方法，如熒光染色、免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blot等，確認(rèn)目的基因是否成功轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中。

☆ 篩選和克�。簩�(duì)于需要進(jìn)一步克隆和擴(kuò)增的細(xì)胞，可以通過(guò)特定的篩選方法，如抗生素篩選、熒光篩選等，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選和克隆。

☆ 擴(kuò)大培養(yǎng)：將篩選出的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以便獲得更多的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)。

☆ 功能驗(yàn)證：在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染后，需要通過(guò)特定的功能驗(yàn)證方法，如ELISA、細(xì)胞活性檢測(cè)、Western blot等，確認(rèn)目的基因是否成功表達(dá)并發(fā)揮作用。

注意：轉(zhuǎn)染載體是指在基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中，用于幫助目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的一些輔助因子。這些載體可以是質(zhì)粒、病毒、人工染色體或其他能自主復(fù)制的DNA分子。

在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，目的基因通常被插入到載體中，以便于將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞。載體可以將目的基因帶到細(xì)胞內(nèi)部，并確保其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在和表達(dá)。常見(jiàn)的轉(zhuǎn)染載體包括質(zhì)粒、噬菌體、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等。

其中，質(zhì)粒是最常用的一種轉(zhuǎn)染載體，它是一種小型環(huán)狀DNA分子，可以在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制。噬菌體則是一種病毒，它能夠?qū)⑵溥z傳物質(zhì)插入到細(xì)菌細(xì)胞中，并利用細(xì)菌的細(xì)胞器進(jìn)行自我復(fù)制。反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒則可以感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，將外源性基因?qū)�入�?xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。

 

2.siRNA轉(zhuǎn)染步驟

① 以下是siRNA轉(zhuǎn)染至受體細(xì)胞的步驟：

 

 

☆ 設(shè)計(jì)siRNA：首先，需要基于目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)siRNA�？梢允褂迷诰�工具或商業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行設(shè)計(jì)（Like us）。一般建議設(shè)計(jì)2-3條siRNA并進(jìn)行驗(yàn)證，以確保特異性和有效性。

☆ 合成siRNA：將設(shè)計(jì)好的siRNA通過(guò)化學(xué)合成方法制備出來(lái)，并進(jìn)行純化和濃縮。通常選擇購(gòu)買現(xiàn)成的siRNA（We have what you want），也可以使用自行合成的siRNA。

☆ 細(xì)胞培養(yǎng)：將所需的受體細(xì)胞培養(yǎng)到適當(dāng)?shù)臄?shù)量和密度。在轉(zhuǎn)染前應(yīng)確保細(xì)胞處于快速增長(zhǎng)期，并且細(xì)胞狀態(tài)良好。

☆ 轉(zhuǎn)染siRNA：根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)或?qū)嶒?yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作流程，將siRNA轉(zhuǎn)染到受體細(xì)胞中。☆ 鑒定：轉(zhuǎn)染后需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，通常24-48小時(shí)后可以進(jìn)行下一步操作。

② siRNA概念及轉(zhuǎn)染作用

siRNA，即小干擾RNA，是一種長(zhǎng)度約為21-25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子。

在轉(zhuǎn)染這一步驟中，siRNA發(fā)揮的作用是誘導(dǎo)靶基因的沉默，進(jìn)而抑制蛋白的表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)siRNA進(jìn)入細(xì)胞后，它能夠與細(xì)胞內(nèi)的mRNA（信使RNA）結(jié)合，導(dǎo)致信使RNA的降解，從而阻止特定蛋白質(zhì)的翻譯。由于這種機(jī)制，siRNA在基因治療和藥物研發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用前景，包括但不限于基因沉默、基因敲除、基因修飾、病毒抑制、細(xì)胞治療以及疫苗研發(fā)等。

 

3.其余轉(zhuǎn)染的基因類型

① miRNA的概念及轉(zhuǎn)染作用

miRNA是一種非編碼RNA，它通常由約20-25個(gè)核苷酸組成，并在真核生物中廣泛存在。miRNA的主要功能是在細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)。它們通過(guò)與靶標(biāo)mRNA相結(jié)合，引發(fā)一系列的生物學(xué)過(guò)程，如抑制mRNA的翻譯或促進(jìn)mRNA的降解。通過(guò)這種方式，miRNA能夠?qū)Χ喾N基因的表達(dá)進(jìn)行精確的調(diào)控，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝和發(fā)育等重要過(guò)程。

在轉(zhuǎn)染至受體細(xì)胞中，miRNA的作用主要是調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)。它們通過(guò)與靶mRNA結(jié)合，影響轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的效率。具體而言，miRNA可以促進(jìn)靶mRNA的降解，從而降低特定基因的表達(dá)水平；也可以抑制靶mRNA的翻譯，進(jìn)一步減少特定基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。通過(guò)這些方式，miRNA能夠精細(xì)地調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)過(guò)程。

miRNA在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答、發(fā)育調(diào)節(jié)等。同時(shí)，異常的miRNA表達(dá)與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。因此，miRNA在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有重要的價(jià)值和潛在的臨床應(yīng)用前景。

② mRNA概念及轉(zhuǎn)染作用

mRNA，全稱為信使RNA，是由DNA上的基因信息轉(zhuǎn)錄而來(lái)的一種核酸分子。在細(xì)胞內(nèi)，mRNA負(fù)責(zé)將DNA上的遺傳信息轉(zhuǎn)錄成可讀取的RNA序列，并傳遞給核糖體，以便合成蛋白質(zhì)。

mRNA的轉(zhuǎn)染作用是指將體外合成的mRNA通過(guò)某種方式導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，利用細(xì)胞內(nèi)的翻譯系統(tǒng)將mRNA翻譯成目標(biāo)蛋白質(zhì)。這種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如mRNA疫苗的研發(fā)和mRNA藥物的生產(chǎn)。

通過(guò)mRNA疫苗的研發(fā)，可以讓人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)病毒的免疫力，達(dá)到預(yù)防病毒感染的目的。此外，利用mRNA編程的細(xì)胞外包裝體可以用來(lái)治療癌癥等疾病。這些外表皮體可以將mRNA輸送到病變區(qū)域，從而激活免疫系統(tǒng)并促進(jìn)治療的效果。

在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，mRNA需要被加工和修飾，以確保其穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)表達(dá)效率和正確的亞細(xì)胞定位。這些加工過(guò)程包括5'端帽子修飾、3'端多聚腺苷酸尾巴的形成等。

相較于其他技術(shù)如蛋白質(zhì)技術(shù)、基因組編輯技術(shù)等，mRNA技術(shù)具有高效性、安全性、制備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)。因此，基于mRNA技術(shù)開(kāi)發(fā)的各種疫苗及藥物將會(huì)是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。

 

六、常用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞

常用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括原代細(xì)胞、原代細(xì)胞衍生物、腫瘤細(xì)胞系、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）、人胚腎細(xì)胞（HEK-293）、人胚肺細(xì)胞（HEL）、人肺癌細(xì)胞（A549）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）、大鼠肝細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等。

人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）：這種細(xì)胞系具有高轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性的特點(diǎn)，常用于基因克隆和疫苗生產(chǎn)。

人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）：這種細(xì)胞系具有高分裂速度和穩(wěn)定性的特點(diǎn)，常用于基因功能研究和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

人骨髓瘤細(xì)胞（U266）：這種細(xì)胞系具有高分化度和穩(wěn)定性的特點(diǎn)，常用于基因克隆和藥物篩選。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH3T3）：這種細(xì)胞系具有低免疫原性和高分裂速度的特點(diǎn)，常用于基因敲除和藥物篩選。

大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6）：這種細(xì)胞系具有高分化度和穩(wěn)定性的特點(diǎn)，常用于藥物篩選和腫瘤研究。

需要注意的是，不同的細(xì)胞類型具有不同的轉(zhuǎn)染效率和特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)人員需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求和細(xì)胞特點(diǎn)選擇適合的轉(zhuǎn)染方法和技術(shù)。