Blotcycler助力先天性腦積水相關致病機制的研究

先天性腦積水（Congenital hydrocephalus，CH）也稱嬰兒腦積水，是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，每1000名新生兒中就有約1人患有 CH。CH早期對智力無影響，晚期可能會出現(xiàn)表情呆滯、智力遲鈍、視力減退和肢體癱瘓，甚至發(fā)生并發(fā)癥而死亡。CH可通過神經(jīng)外科 分流進行治療，但手術存在較大風險及并發(fā)癥。因此研究CH的發(fā)病機制，開發(fā)新的CH預防、診斷和治療方法顯得至關重要。

已有研究證明神經(jīng)分化不平衡是CH發(fā)生的主要原因�；�于多種模式生物的遺傳學研究，發(fā)現(xiàn)在胚胎和神經(jīng)干細胞中大量表達Trim71， 一種保守的、干細胞特異的、RNA結合蛋白（RBP），對早期胚胎發(fā)生一定的神經(jīng)分化密切相關。Trim71的RNA結合結構域內(nèi)有多個CH 作用的突變位點，可以改變Trim71的RNA結合能力，然而，這種突變?nèi)绾螌е赂杉毎�分化缺陷和神�?jīng)形成缺陷的分子機制仍不完全清楚。

 

來自梅奧診所的Qiuying Liu等人，針對Trim71中兩個CH相關突變——R595H-Trim71和R783H-Trim71進行了研究，相關研究成果以“Different congenital hydrocephalus – associated mutations in Trim71 impair stem cell differentiation via distinct gain-of-function mechanisms”為題，發(fā)表在PLOS Biology上。

因為Trim71突變體引起的CH發(fā)病機制在小鼠和人類之間是保守的，因此作者使用小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cells ， mESCs）為模型，來研究Trim71中CH相關突變的分子機制。作者通過基因敲除和基因編輯技術，在Trim71中引入R595H或R783H，獲得 四個突變mESC系，分別代表單等位基因（R595H/+，R783H/+）和雙等位基因突變（R595H，R783H），然后采用蛋白免疫印跡雜交 （Western Blot）、免疫熒光，CLIP-seq, RNA-seq等手段，與野生型mESCs進行一系列的比較分析。結果發(fā)現(xiàn)盡管跟之前的報道一樣 ，Trim71中的CH相關突變R595H和R783H加速了mESCs的分化，增強了神經(jīng)細胞系的定型，減少了與野生型Trim71靶向mRNA的結合。然 而每個Trim71突變體都結合不同的異位靶mRNAs亞群。R595H-Trim71與編碼β-連環(huán)蛋白的信使核糖核酸結合，并抑制其翻譯。增加β -連環(huán)蛋白水平可減輕R595H-Trim71 mESCs的分化缺陷，但不能減輕R783H-mESCs中的分化缺陷。這些結果意味著Trim71的RNA結合結 構域的功能發(fā)生突變，通過不同的病理機制引起CH，CH患者可以根據(jù)這些不同的機制進行分層，針對遺傳多樣的CH病因設計精確的治療策略。

文中所有的蛋白免疫印跡雜交（Western Blot）操作，均通過美國Precision Biosystems公司提供的全自動蛋白質印跡雜交系統(tǒng)Blotcycler完成。

 

Sox1和Pax6是神經(jīng)外胚層特異性所必需的兩種譜系特異性轉錄因子，與野生型mESCs相比，在兩種Trim71突變體mESCs的定向神經(jīng)分化過程中表現(xiàn)出更高的表達（圖1 紅框）

R595H-Trim71 mESCs特異性顯示β-連環(huán)蛋白水平降低，而Ctnnb1 mRNA水平?jīng)]有變化（圖2紅框）。

R595H-Trim71在WT mESCs中的異位表達降低了β-連環(huán)蛋白水平，而沒有降低Ctnnb1mRNA水平（圖3紅框）。

 

來自美國Precision Biosystems公司的Blotcycler，是一款全自動的蛋白質印跡雜交系統(tǒng)，Western Blot洗液工作站，可自動化完成封閉、孵育、清洗和一抗回收的一系列工作，很好地解放您的雙手。更為重要和有意義的是：專利的流體清洗可以減少二抗在膜上的附著，降低背景，提高信噪比和靈敏度；自動化的操作流程避免了手工操作帶來的誤差，保證了批次內(nèi)和批次間實驗的高度重復性；高通量操作和多條件的設定可以輔助您優(yōu)化Western Blot 實驗的條件，例如合適的抗體濃度等，開放的實驗平臺，無需其他額外投入。Blotcycler是從事Western Blot實驗的科研工作者的最佳選擇。

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https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001947 

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