《Advanced Science》：3D打印自吸附干細胞支架治療脊髓損傷

脊髓損傷是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全球每年新增病例超過50萬例。由于神經(jīng)回路重建困難以及病灶區(qū)周圍惡劣的組織微環(huán)境，通常導致患者的不良預后。目前，手術(shù)清創(chuàng)減壓以及激素療法是臨床上的常用手段，但該方案無益于重建受損的神經(jīng)回路。近些年的臨床前研究已經(jīng)開發(fā)出多種人工脊髓，然而，如何提高細胞移植物的活性和負載效率，如何規(guī)避干細胞在安全性和倫理性上的風險，如何簡化細胞接種過程以及制造標準化的水凝膠支架，從而開發(fā)一種更加符合臨床應用場景的人工脊髓組織，一直是該領域亟待解決的問題。

近期，浙江大學生命科學學院余路陽教授團隊與浙江大學機械工程學院賀永教授團隊合作，圍繞構(gòu)建適合臨床轉(zhuǎn)化應用的人工脊髓這一科學問題，基于高精度光固化3D打印水凝膠支架以及人羊膜上皮干細胞（hAESCs）這類新型圍產(chǎn)期干細胞，同時開發(fā)新型后處理工藝，實現(xiàn)了水凝膠支架對于細胞移植物的自促進吸收，極大簡化了細胞接種過程的操作難度，提高了細胞的負載量以及遞送效率。并發(fā)揮人羊膜上皮干細胞在免疫調(diào)節(jié)以及神經(jīng)營養(yǎng)上的功能，在大鼠脊髓損傷模型的修復中展現(xiàn)出較高的臨床轉(zhuǎn)化和應用潛力。相關(guān)工作“A 3D-Printed Dual Driving Forces Scaffold with Self-Promoted Cell Absorption for Spinal Cord Injury Repair”發(fā)表于《Advanced Science》雜志。


圖1 具有自促進吸附能力的脊髓支架的設計和制造思路

1. 開發(fā)雙驅(qū)動力模型及后處理工藝
隨著3D打印技術(shù)的不斷發(fā)展，產(chǎn)生了越來越多具有復雜結(jié)構(gòu)的支架產(chǎn)品。然而，由于重力以及支架內(nèi)部復雜結(jié)構(gòu)所帶來的高流阻特性，使得常規(guī)細胞接種方法無法獲得令人滿意的支架表面利用率以及細胞的均勻分布。對于載細胞打印而言，不可避免的會對細胞活性以及狀態(tài)造成影響。因此，作者提出了分離支架制造與細胞接種過程，開發(fā)新型后處理工藝的思路。

通過組合烘干干燥和冷凍干燥各自的優(yōu)點，作者開發(fā)了一種具有宏觀+微觀吸收力的后處理方法，并解釋了其作用機理。具體來說，水凝膠支架中75%的水分通過烘干干燥去除后，支架的宏觀體積會大大縮小，從而能夠在復水過程中給予細胞最大的吸收力；而剩余水分將利用冷凍干燥方法去除，從而使得支架遍布相互連通的微小空隙，各個方向的毛細作用能夠克服重力影響，使細胞能夠貼附在各方向的支架表面。結(jié)果顯示，經(jīng)過該方法處理后的水凝膠支架（HES）不僅具有良好的親水性和吸水速度，而且具有最大的體積膨脹程度，有利于細胞的吸附及負載。

圖2 雙驅(qū)動力吸收模型的開發(fā)

2. 高效hAESCs遞送系統(tǒng)的開發(fā)
在雙驅(qū)動力模型基礎上，作者進一步檢測了HES支架負載細胞的能力。得益于HES支架強大的吸附能力，使得整個細胞吸收過程能夠在2分鐘內(nèi)完成，因此，作者展示了高載量HES-hAESCs輸送系統(tǒng)的實際操作過程。便利且標準化的操作過程有利于后續(xù)臨床前以及未來臨床轉(zhuǎn)化。熒光結(jié)果顯示，細胞實現(xiàn)了在HES支架上的均勻分布，且細胞能夠貼附到支架內(nèi)部各個方向的表面。定量結(jié)果顯示，HES支架的細胞負載能力極大提高，最終的細胞密度可達到5 × 10⁴ cells/mm³.


圖3 高載量和均勻分布的HES-hAESCs輸送系統(tǒng)

3. HES-hAESCs脊髓支架改善大鼠模型的后肢運動功能
接下來作者在大鼠脊髓損傷模型中探究HES-hAESCs脊髓支架的治療效果。結(jié)果顯示，移植8周后大鼠的后肢運動功能明顯改善，表現(xiàn)為后肢出現(xiàn)連續(xù)性的負重行走。電生理數(shù)據(jù)顯示，后肢肌肉電位恢復明顯，電信號振幅明顯增強，可恢復至正常大鼠的40%以上；另外，電信號延時明顯縮短，提示移植HES-hAESCs脊髓支架能夠明顯增強病灶區(qū)內(nèi)下行運動神經(jīng)回路的重建。


圖4 HES-hAESCs改善大鼠后肢運動功能

4. HES-hAESCs脊髓支架促進受損的神經(jīng)回路重建
隨后，作者進一步檢測脊髓支架對于病灶區(qū)內(nèi)神經(jīng)纖維的恢復作用。結(jié)果顯示，HES-hAESCs支架明顯增強病灶區(qū)內(nèi)神經(jīng)纖維的延伸生長以及成熟程度，hAESCs的存在顯著提高了支架微孔道內(nèi)的神經(jīng)纖維數(shù)量，部分神經(jīng)纖維表達特定亞型神經(jīng)元標志物，與行為學檢測結(jié)果相一致。另外，掃描電鏡結(jié)果顯示，HES-hAESCs組大鼠病灶區(qū)內(nèi)部神經(jīng)纖維的髓鞘化程度明顯提高，提示脊髓支架的存在能夠促進神經(jīng)回路的重建以及進一步成熟。


圖5 HES-hAESCs促進病灶區(qū)內(nèi)神經(jīng)纖維生長和髓鞘形成

綜上所述，雙驅(qū)動力吸附模型為水凝膠支架實現(xiàn)自促進的細胞接種吸收提供了新的方法與原理，HES支架作為一個強大的細胞遞送工具，為以hAESCs為代表的臨床級干細胞治療提供了新方法，具有極大的臨床轉(zhuǎn)化應用潛力。

文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.202301639