細(xì)胞外囊泡 EVs的應(yīng)用之疾病診斷篇

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)作為細(xì)胞間信息傳遞的重要載體，其運(yùn)載的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生化分子在疾病的早期篩查、預(yù)后檢測(cè)和藥物的療效評(píng)估中具有重大潛力和臨床應(yīng)用價(jià)值。相比于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，EVs與細(xì)胞的生理狀態(tài)聯(lián)系緊密，可實(shí)時(shí)反映疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程；此外，EVs來(lái)源廣泛且含量豐富，可以從尿液、血液、唾液和眼淚等生物液體中獲得，并可跨越血腦屏障等生物組織屏障。

來(lái)自美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)的學(xué)者檢索并分析了CAS數(shù)據(jù)庫(kù)中EVs在治療和診斷領(lǐng)域中應(yīng)用研究的發(fā)表情況。如圖1所示，EVs在多種疾病的治療和診斷被廣泛研究，其中與癌癥相關(guān)研究更是備受關(guān)注，文章數(shù)量占比高達(dá)68%。
 

圖1. EVs在疾病治療和診斷中的應(yīng)用相關(guān)的文章分布

01 基于EVs蛋白的診斷方法
蛋白質(zhì)作為EVs的重要組分，一直以來(lái)都是領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)。四次跨膜蛋白(Tetraspanins)作為EVs中蛋白豐度最高的一類(lèi)膜蛋白，被用于多種疾病的診斷和檢測(cè)。其中，CD63在各種類(lèi)型的人類(lèi)癌癥細(xì)胞分泌的EVs中升高，如黑色素瘤患者血漿中CD63蛋白陽(yáng)性的EVs的濃度顯著提高。CD81則在丙型肝炎中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，與炎癥和纖維化相關(guān)，被認(rèn)為是丙型肝炎診斷標(biāo)志物。CD151、CD171和TSPAN8則在肺癌患者的血清EVs中的表達(dá)量顯著提高。

來(lái)自廈門(mén)大學(xué)顏曉梅教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)NanoFCM分析了正常腸上皮細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞來(lái)源的EVs，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌的EVs中表達(dá)CD147的類(lèi)群所占的比例遠(yuǎn)高于正常腸細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)健康人和結(jié)直腸癌患者血漿中CD147陽(yáng)性的EVs顆粒濃度存在顯著差異，且這種差異在Ⅰ期患者中即可體現(xiàn)。該團(tuán)隊(duì)測(cè)定血漿中表達(dá)EBV編碼的膜蛋白LMP1和LMP2A，以及其他腫瘤標(biāo)志物PD-L1、EGFR和EpCAM的EVs顆粒濃度，建立了快速、可靠、無(wú)創(chuàng)的鼻咽癌診斷方法；同時(shí)發(fā)現(xiàn)了LMP1和LMP2A陽(yáng)性的EVs在甄別鼻咽癌和鼻咽炎方面具有臨床潛力（參見(jiàn)往期文章：廈大團(tuán)隊(duì)揭秘如何通過(guò)EVs區(qū)分癌癥和炎癥）。

此外，尿液中EVs含量豐富，且無(wú)侵入性、易獲得也引起了大家的關(guān)注，被廣泛用于疾病篩查。例如，尿液的EVs被發(fā)現(xiàn)是膀胱癌、前列腺癌和腎癌等泌尿系統(tǒng)疾病的潛在生物標(biāo)志物。

表1. 常見(jiàn)可應(yīng)用于液體活檢的EVs蛋白

 

02 基于EVs核酸的診斷方法
由于受到脂質(zhì)雙層脂膜的保護(hù)，EVs運(yùn)載的核酸片段可免于被體液中RNA酶降解的命運(yùn)。其中EVs所運(yùn)載的miRNA分子是最為常見(jiàn)的診斷靶標(biāo)，如下表2所示，EV-miRNA已被用于非小細(xì)胞肺癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腸癌等不同類(lèi)型癌癥的診斷研究中。來(lái)自路易斯維爾大學(xué)的Guilherme Rabinowits等通過(guò)核酸測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者血液中EV-miRNA與對(duì)照組具有差異顯著，說(shuō)明EV-miRNA在肺腺癌篩查的潛力。哈肯薩克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的研究人員發(fā)現(xiàn)EVs中miR-141被發(fā)現(xiàn)可作為前列腺癌的有效診斷標(biāo)志物，且目前正在招募臨床試驗(yàn)者(NCT03694483)，以開(kāi)發(fā)基于EVs miR-141的前列腺癌癥液體活檢方法。而美國(guó)Exosome Diagnostics公司則開(kāi)發(fā)了一種基于尿液EVs的簡(jiǎn)單液體活檢方法——ExoDx，該方法使用EVs中ERG、PCA3和SPDEF的RNA拷貝數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)前列腺癌的早期篩查。除癌癥之外，EV-RNA也被用于心血管疾病、腎纖維化以及病毒感染等疾病的診斷中。例如，來(lái)自溫州醫(yī)科大學(xué)的研究者研究了淚液來(lái)源EVs中的miR-145-5p、miR-214-3p、miR-218-5p和miR-9-5p與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。

然而，目前針對(duì)EV-RNA的分析方法往往通過(guò)RNA提取后，再進(jìn)行采用qRCR或者核酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析。EV-miRNAs的原位分析可能為解決上述缺點(diǎn)提供了另一種策略，即通過(guò)將特定的探針加載到單個(gè)EV中，使探針與miRNA結(jié)合并放大miRNA信號(hào)來(lái)直接檢測(cè)，從而避免EV裂解和RNA提取。來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院的研究者提出EV-miRNA的原位分析技術(shù)，即基于DNA納米線引導(dǎo)催化的發(fā)夾組裝系統(tǒng)(NgCHA)的EV-miRNA原位檢測(cè)，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步結(jié)合NanoFCM實(shí)現(xiàn)了單EVs水平對(duì)于某一特定序列miRNA的表達(dá)分析，其性能優(yōu)于傳統(tǒng)的CHA和MB探針，該方法拓展了EV-RNA作為診斷工具的應(yīng)用價(jià)值和臨床潛力。
 

表2. EV-miRNA在癌癥診斷中的應(yīng)用

03 EVs相關(guān)診斷標(biāo)志物臨床獲批情況
目前，EVs在疾病診斷的應(yīng)用仍處于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究階段，獲得監(jiān)管部門(mén)批準(zhǔn)和商業(yè)應(yīng)用的產(chǎn)品較少。2016年，Exosome Diagnostics公司的EVs癌癥診斷產(chǎn)品ExoDx Lung(ALK)獲批上市，成為全球首個(gè)獲批的EVs診斷產(chǎn)品，基于簡(jiǎn)單的尿液EVs液體活檢方法，該方法可快速檢測(cè)出前列腺癌患者中的EML4-ALK突變，達(dá)到了88%的靈敏度和100%的特異性，可用于協(xié)助早期診斷前列腺癌，避免不必要的前列腺活檢，該方法已于2019年獲得FDA認(rèn)證。

Biological Dynamics開(kāi)發(fā)了一種早期診斷檢測(cè)，利用交流電動(dòng)力學(xué)(ACE)從血液中分離EVs，研究表明該檢測(cè)可在腫瘤Ⅰ期就識(shí)別胰腺癌。2023年Biological Dynamics宣布完成了其實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)測(cè)試(LDT)的分析和臨床驗(yàn)證，且目前正在推進(jìn)與多中心合作進(jìn)行胰腺癌早篩臨床試驗(yàn)，加快該技術(shù)以LDT模式落地的探索過(guò)程。近期Biological Dynamics在《腫瘤學(xué)前沿》上發(fā)表病例報(bào)告“通過(guò)EVs液體活檢的多模式方法早期檢測(cè)胰腺癌前病變”。

國(guó)內(nèi)方面，2022年2月，中國(guó)NMPA授予了上海思路迪的EVs卵巢癌輔助診斷試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）以?xún)?yōu)先審批，是國(guó)內(nèi)首款同品種產(chǎn)品獲準(zhǔn)注冊(cè)的醫(yī)療器械。此外，堯景基因基于糖鏈細(xì)胞外囊泡開(kāi)發(fā)的GlyExo-Capture技術(shù)并基于該技術(shù)開(kāi)發(fā)的肝癌檢測(cè)試劑盒已完成注冊(cè)檢驗(yàn)，目前正在開(kāi)展多中心臨床研究，對(duì)于細(xì)胞外囊泡技術(shù)走向臨床應(yīng)用具有里程碑意義。

04 EVs分離純化方法的評(píng)估
EVs往往存在于組成成分高度復(fù)雜的體液之中，而如何從復(fù)雜的體液中以最少的樣本量獲得高純度的EV樣本，一直是該領(lǐng)域中亟需突破的瓶頸。表3所示是常用的EVs純化方法，無(wú)論是經(jīng)典的超離法，還是新進(jìn)發(fā)展的聚合物沉淀、免疫捕獲以及超濾等方法，均展現(xiàn)了各自的優(yōu)勢(shì)和局限性。然而不管選用何種分離純化方法，都需要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制以確保EVs的富集效率和樣本純度。

1.超速離心法
基于多次差速離心和100,000 g左右的強(qiáng)離心力實(shí)現(xiàn)EVs的分離純化，是目前最常用的EVs分離方法之一。然后該方法較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且易造成樣本的大量損失。而密度梯度離心則是在差速離心法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)鋪設(shè)密度層，利用密度這一性質(zhì)以實(shí)現(xiàn)EVs和其他雜質(zhì)的再度分離，以獲取更高純度的EVs樣本。

2.超濾法
一種基于尺寸的EVs分離純化方法，通過(guò)具有特定孔徑（限制了它們的分子量和尺寸）的膜過(guò)濾器來(lái)實(shí)現(xiàn)EVs的截留和分離。

3.尺寸排阻色譜(SEC)
則利用不同大小的顆粒流經(jīng)填充柱的路徑和時(shí)間差異以實(shí)現(xiàn)EVs和其他粒徑較小的雜質(zhì)顆粒的分離。目前SEC已用于從血漿、尿液、唾液和眼淚等體液中分離、純化和富集EVs。

4.聚合物沉淀法
通過(guò)聚合物對(duì)EVs進(jìn)行包裹，借助低速離心的方法使EVs從生物體液中沉淀出來(lái)。這種方法易于操作，可應(yīng)用于大量樣本的處理；然而該方法往往也會(huì)伴隨著體液中其他雜質(zhì)顆粒的分離，且引入聚合物粒子而影響獲得的EVs樣本純度。

5.微流控裝置
可以在微小的通道內(nèi)基于尺寸、密度和免疫親和性等特性來(lái)實(shí)現(xiàn)EVs的分離純化。微流控裝置體積小，且該方法樣本需求量低，在降低了時(shí)間和試劑花費(fèi)的基礎(chǔ)上，可快速獲得純度較高的EVs樣本；然而該方法也存在著裝置較為復(fù)雜、價(jià)格昂貴和對(duì)操作者需要一定的實(shí)驗(yàn)技能等要求。

6.免疫親和法
利用抗體和 EVs表面蛋白之間的相互作用來(lái)分離EVs。目前已有方法利用EVs膜表面的磷酯酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)、CD9和CD63等生物分子與受體蛋白Annexin V以及對(duì)應(yīng)抗體的高度選擇性和親和性，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血漿、尿液等多種體液中的EVs的分離純化以及高效標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間、高純度、結(jié)構(gòu)完整的EVs獲取以及標(biāo)記。整個(gè)過(guò)程基于磁分離進(jìn)行，使得EVs的捕獲及標(biāo)記洗滌簡(jiǎn)單易行。
 

表3. 用于EV分離純化的主要方法

基于不同來(lái)源EVs的高度異質(zhì)性以及來(lái)源環(huán)境的復(fù)雜性，如何實(shí)現(xiàn)分離純化和質(zhì)量控制，都是其臨床應(yīng)用的限速步。EVs粒徑分布廣(40-1000 nm)，但是主要集中分布于200 nm以下。結(jié)合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測(cè)技術(shù)，廈門(mén)福流生物創(chuàng)始團(tuán)隊(duì)研發(fā)成功具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的納米流式檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)低至7 nm的納米金顆粒和24 nm低折射率二氧化硅納米顆粒散射光的直接檢測(cè)；同時(shí)配備多色熒光檢測(cè)功能，進(jìn)一步揭示顆粒的生物化學(xué)性質(zhì)。納米流式檢測(cè)技術(shù)使得研究人員能夠像使用傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞那樣對(duì)EVs進(jìn)行多參數(shù)定量檢測(cè)。如下圖2所示，通過(guò)對(duì)單個(gè)納米顆粒(7-1000 nm)的粒徑、濃度以及生物化學(xué)性質(zhì)的高分辨、高選擇性、高通量檢測(cè)，為生命科學(xué)研究以及生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了一個(gè)強(qiáng)有力的表征手段。
 

圖2. 基于NanoFCM的EVs單顆粒水平分析

A. EVs的粒徑表征；B. 經(jīng)跨膜核酸染料標(biāo)記，EVs的核酸分析；C. EVs表面蛋白CD9和CD63的共定位分析

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