一次性生物反應(yīng)器放大工藝介紹

1.介紹

利用攪拌式生物反應(yīng)器(STR)在哺乳動物細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生許多治療性蛋白質(zhì)(例如，單抗、融合蛋白、酶)。生物反應(yīng)器提供了對最佳細胞生長和蛋白質(zhì)生產(chǎn)的關(guān)鍵參數(shù)的控制，如溫度、溶解氧(DO)和pH。根據(jù)產(chǎn)品和工藝的特點，重組蛋白的生產(chǎn)有多種細胞培養(yǎng)方法，包括分批、重復分批、補料分批和灌流。還使用了系列細胞類型(如CHO、NS0、BHK、PER.C6)。其中CHO是最廣泛使用的。在小規(guī)模生物反應(yīng)器中開發(fā)制造工藝，然后擴大到所需的大規(guī)模生產(chǎn)制造規(guī)模。生產(chǎn)規(guī)模由市場需求和工藝經(jīng)濟決定。目前，高達10,000-25,000L的大型生物反應(yīng)器通常用于基于哺乳動物細胞培養(yǎng)的生物制劑生產(chǎn)。由于所需的流體動力學條件和培養(yǎng)需求的差異，細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器與微生物生物反應(yīng)器的設(shè)計和放大可能有很大不同。

在過去的幾十年里，對生物反應(yīng)器放大的了解一直在穩(wěn)步增加，但大型生物反應(yīng)器由于其在混合和傳質(zhì)方面的局限性，本質(zhì)上更難操作。隨著生物反應(yīng)器規(guī)模的增加，混合時間的增加，都是生物反應(yīng)器操作和規(guī)模平移中的一個挑戰(zhàn)。此外，細胞、培養(yǎng)基和工藝的改進將細胞密度推到了更高的水平，從而對擴大規(guī)模提出了新的挑戰(zhàn)。

近年來，一次性生物反應(yīng)器在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用，一次性生物反應(yīng)器已迅速應(yīng)用于臨床生產(chǎn)，并正在進入商業(yè)生產(chǎn)。艾貝泰生物科技有限公司現(xiàn)提供多種型號的一次性生物反應(yīng)器。反應(yīng)器中空袋主要由塑料制成，設(shè)計為一次性使用，從而消除了不銹鋼(SS)設(shè)計的原位清洗(CIP)和原位滅菌(SIP)方面的問題。一次性生物反應(yīng)器的使用是由改進的細胞培養(yǎng)過程和設(shè)施經(jīng)濟帶來的產(chǎn)品高濃度驅(qū)動的。放大方法和操作與不銹鋼生物反應(yīng)器有很大的相似之處。但是具有獨特的操作問題，例如袋壓和混合，討論了這些方面對放大的影響。
 

2.工程參數(shù)

表1列出了哺乳動物培養(yǎng)中通常認為的工程參數(shù)，隨后詳細描述了不同的參數(shù)。一些參數(shù)，如單位體積功率輸入(P/V)和流量數(shù)(F1)取決于流型，并給出了假設(shè)完全湍流的表達式。表中還顯示了不同參數(shù)之間的相互依賴關(guān)系。
 

表1—使用不同標準從3L生物反應(yīng)器放大到20,000L生物反應(yīng)器。

原文提供了詳細的工程參數(shù)計算方式和含義的說明，本文不進行贅述。
 

2.1氣體傳輸

（1）O₂供應(yīng):細胞培養(yǎng)上清液與空氣平衡時的氧氣濃度約為0.19 mM。細胞比氧攝取率(qO2)為4 pmol/cell/day，細胞密度為10⁹/ml的培養(yǎng)物在幾分鐘內(nèi)就會消耗掉氧氣。因此，必須不斷地向培養(yǎng)物供應(yīng)氧氣。使用空氣或氧氣時，氧氣的體積傳質(zhì)系數(shù)Kla(由氧氣傳遞率(OTR定義)需要約為2h^-1‬才能支持該培養(yǎng)。
 

圖1細胞比氧攝取率(qO2)在1-10 pmol/cell/day范圍內(nèi)的哺乳動物細胞的估計Kla需要量。
 

（2）CO₂供應(yīng): 通過逸度(pCO₂)來描述的溶解CO₂水平的控制，在細胞培養(yǎng)過程中與碳酸氫鹽(HCO)的解離平衡中也是至關(guān)重要的。高溶解CO₂水平會抑制細胞生長，產(chǎn)生代謝壓力，甚至導致細胞死亡，影響培養(yǎng)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。低溶解CO₂水平也可以減緩生長和影響性能，因為HCO₃^-介導了一些細胞過程，如戊糖磷酸途徑和補充復變中間體。培養(yǎng)物中的細胞也通過兩種機制影響溶解的CO₂水平。第一種是細胞的有氧呼吸，呼吸商RQ=CER/OUR約為0.8至1。第二個經(jīng)常被忽視的是培養(yǎng)物產(chǎn)生的酸，主要是乳酸，它通過以下反應(yīng)與培養(yǎng)物中的重碳酸鹽反應(yīng)：

 

在許多培養(yǎng)開始時，當細胞密度低，乳酸產(chǎn)量高時，這種機制產(chǎn)生的二氧化碳可以超過有氧呼吸產(chǎn)生的CO₂。該反應(yīng)還將HCO₃^-轉(zhuǎn)化為CO₂‬，對pH的影響比單獨產(chǎn)生二氧化碳的影響更大。為了保持恒定的pH值，要么必須添加堿，要么需要非常有效地去除CO₂。

（3）氣體傳遞技術(shù)和氣體傳遞系數(shù)的確定: 細胞培養(yǎng)最常用的兩種技術(shù)是小型生物反應(yīng)器的表面轉(zhuǎn)移和用于大型生物反應(yīng)器的直接通氣。

O₂的氣體傳遞系數(shù)Kla通常是通過經(jīng)典的瞬時放氣方法測量的，即用N₂降低DO水平，然后用空氣或氧氣來提高DO水平。在N₂剝離和Air/O₂通氣過程中，都可以使用與氣體平衡的適當O₂濃度；N₂為0，Air為0.19 mM，O₂為0.9 mM，來估算Kla。為了計算Kla，假定氣體和液體和塞狀流是完全混合的。在細胞存在的情況下，通過停止Air或O₂通入并允許DO下降到較低水平來測量它。

CO₂‬氣體傳遞系數(shù)kla，由于CO2‬的高溶解度，氣體在生物反應(yīng)器中上升時會與介質(zhì)中的CO_2‬平衡。CO₂‬的實際去除取決于通氣中CO_2‬的平衡程度。

從實驗室規(guī)模的生物反應(yīng)器到中試和大型的生物反應(yīng)器的放大會導致氣體轉(zhuǎn)移過程中的損失。這會隨著規(guī)模的擴大而影響培養(yǎng)物的O₂和CO₂水平。假設(shè)培養(yǎng)物消耗或生產(chǎn)相同，對于較大的生物反應(yīng)器，除了最低密度的培養(yǎng)物外，表面氣體對O₂的轉(zhuǎn)移是不夠的。對于CO₂，在從實驗室規(guī)模擴大的過程中，CO₂表面去除的損失是造成CO₂積累的主要因素。Air通常在放大中對Sparger設(shè)計的更改以彌補損失。

2.2攪拌

攪拌最常見的放大標準是P/V如前所述。按比例放大會導致P/V隨著V^5/3的增加而增加，這涉及到使用比在實驗規(guī)模下使用的高徑比更高的容器，也就是說，在可用的設(shè)備下，尺寸上的相似性通常是不可行的。如果不使用多個葉輪，這對混合時間有負面影響。超過1:1的H:T(生物反應(yīng)器高度:生物反應(yīng)器直徑)比，對t_m∝(H/T)^2.5有很強的依賴性。使用多個葉輪時，可以從單獨的混合區(qū)進行較慢的混合。P/V與混合時間有關(guān)，因此代表均勻化速率。P/V 也與平均P/V相關(guān)，因此代表了潛在的水動力損傷。它是一個比例如葉尖速度更合適的比例放大。特別是按葉頂速度放大會導致混合時間過差。雖然P/V是一個很好的放大標準，但也具有一定的風險。
 

3.放大過程中葡萄糖代謝溢出

雖然在哺乳動物細胞培養(yǎng)放大過程中很少觀察到葡萄糖代謝溢出，但有注意到葡萄糖/乳酸代謝隨規(guī)模的增加而變化的情況，在擴大規(guī)模期間觀察到葡萄糖消耗和乳酸生成率的增加。雖然葡萄糖代謝溢出的原因可能有所不同，可以肯定的是，葡萄糖代謝效率低下與培養(yǎng)性能受損有關(guān)。葡萄糖和乳酸代謝的這種變化導致額外的堿添加和滲透壓增加，這兩者都可能對工藝性能產(chǎn)生負面影響。
 

4.高密度培養(yǎng)

隨著高灌流率和中空纖維過濾裝置的應(yīng)用，在灌注培養(yǎng)中可以達到非常高的密度，達到 50 ~ 100 × 10^{^6}cells/mL，甚至更高。例如，使用切向流過濾系統(tǒng)可達到 214 × 10^{^6}cells/mL的 CHO 細胞密度，使用交替切向流系統(tǒng)可達到 132×10^{^6}cells/ mL。細胞密度增大的同時，粘度也會增大，可能在影響工藝性能。
 

5.規(guī)模化的一次性生物反應(yīng)器設(shè)計

大多數(shù)一次性生物反應(yīng)器的設(shè)計方式類似于標準的圓柱形SS攪拌生物反應(yīng)器。葉輪和電機的位置根據(jù)設(shè)計而有所不同，其中使用頂部或底部安裝的電機。攪拌是由預(yù)先安裝的葉輪提供的，這些葉輪附著在頂部或通過支撐基座。生物反應(yīng)器內(nèi)的 pH、DO、溫度等監(jiān)測采用與傳統(tǒng) SS 罐類似的探針和技術(shù)。除了圓柱形攪拌槽外，還開發(fā)了采用不同幾何形狀和/或攪拌和混合機制的替代一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)。

放大一次性反應(yīng)器采用與不銹鋼生物反應(yīng)器類似的方法，例如，P/V仍然是反應(yīng)器的推薦放大標準。反應(yīng)器中的細胞培養(yǎng)性能已被證明與使用類似放大標準的不銹鋼生物反應(yīng)器中的細胞培養(yǎng)性能相當。

生物反應(yīng)器壓力:不銹鋼生物反應(yīng)器通常在正壓下運行;在SS系統(tǒng)中可以壓力增加，但在一次性反應(yīng)系統(tǒng)中則不能。相反，SUBs中的壓力被密切監(jiān)測，以避免袋壓過壓(例如，某些系統(tǒng)<1psi;當壓力超過最大允許值時，系統(tǒng)關(guān)閉控制器。

雙曝氣系統(tǒng):為了實現(xiàn)所需的氧氣傳遞和二氧化碳去除，通常使用雙曝氣系統(tǒng)，包括毫米孔徑的通氣口(如鉆孔，用于空氣/N₂)和微米孔徑的通氣口(如燒結(jié)口，用于O₂/CO₂)。雖然雙通氣口也用于SS生物反應(yīng)器，但毫米孔徑的分散器與顆粒分散器的組合在一次性反應(yīng)器中更為普遍。

這些通氣口產(chǎn)生的氣泡直徑只有幾到幾十毫米;通常認為，在正常的PF68濃度下，它們對細胞健康的風險很低，甚至沒有風險。由于這些生物反應(yīng)器一次性袋是定制的，因此可以定制分散器設(shè)計以滿足特定的工藝需求。

在使用時，生物反應(yīng)器PID控制回路的調(diào)整可能會更加復雜。
 

6.一次性生物反應(yīng)器混合性能的改進

在典型的放大標準下，隨著生物反應(yīng)器規(guī)模的增加而增加，這將增加大型生物反應(yīng)器中添加極端pH值溶液時的pH非均質(zhì)性�；旌系母倪M有望進一步提高工藝性能，因為混合不充分會導致局部pH梯度，會對哺乳動物培養(yǎng)物的性能產(chǎn)生負面影響�？梢酝ㄟ^優(yōu)化葉輪配置、生物反應(yīng)器長徑比和擋板設(shè)計來優(yōu)化。艾貝泰生物科技有限公司自研的一次性生物反應(yīng)器是立方體設(shè)計，具有天然擋板，增加了生物反應(yīng)器內(nèi)的湍流，在使用過程中具有優(yōu)越的混合時間數(shù)據(jù)，在最低攪拌轉(zhuǎn)速時，混合時間改善明顯，將對整體培養(yǎng)性能產(chǎn)生積極影響。同樣支持細胞生長和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。由于具有諸如改善混合條件或降低剪切等額外好處，其中一些設(shè)計可以很好地滿足特定的工藝需求。
 

7.總結(jié)

雖然細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器放大方法在過去十年中已經(jīng)相對成熟，但仍在尋求進一步優(yōu)化的改進。部分原因是由于生物反應(yīng)器設(shè)計的局限性，由于氣體傳輸和混合限制，歷史設(shè)計可能不適合新工藝的采用。使放大性能進一步復雜化的是，許多“放大”挑戰(zhàn)是由不同規(guī)模的生物反應(yīng)器設(shè)計差異驅(qū)動的。盡管有各種各樣的分散器和葉輪設(shè)計可供選擇，但改造現(xiàn)有設(shè)施以適應(yīng)不同的工藝/產(chǎn)品開發(fā)環(huán)境并非易事。放大性能受損通常是由于設(shè)備的差異和限制。

作為一次性應(yīng)用系統(tǒng)中極為重要的產(chǎn)品體系，隨著國內(nèi)生物制藥行業(yè)近年來的高速發(fā)展，越來越多的用戶開始關(guān)注擁有更強功能性、更高效性和易用安全的一次性生物反應(yīng)器。針對研發(fā)、臨床前、臨床階段以及生產(chǎn)階段的商業(yè)化項目，一次性反應(yīng)器都獨具優(yōu)勢。艾貝泰作為國內(nèi)始終致力于生物制藥行業(yè)工藝解決方案的理想供應(yīng)商。