一篇講透：干細(xì)胞轉(zhuǎn)染及基因編輯

目前有多種方法可以將基因?qū)�入真核�?xì)胞內(nèi)，一般可分為病毒類載體技術(shù)和非病毒類載體技術(shù)，后者具有低毒性和低免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，且不受細(xì)胞或種屬特異機(jī)制和導(dǎo)入片段大小等限制的優(yōu)勢。其中，電穿孔法以其較高的轉(zhuǎn)染率而備受關(guān)注。電穿孔法是應(yīng)用短暫的高壓電流脈沖誘導(dǎo)活細(xì)胞產(chǎn)生跨膜電位，由于外加電場強(qiáng)度大于細(xì)胞膜穿孔的臨界值，引起細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)暫時(shí)性改變，形成納米級微孔，DNA等外源物質(zhì)通過這些微孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。

大多數(shù)細(xì)胞通過傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染技術(shù)就可以提高轉(zhuǎn)染效率，而原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、干細(xì)胞等難以通過傳統(tǒng)方法獲得高轉(zhuǎn)染效率，成為困擾科研人員的難題。NEPA GENE公司在細(xì)胞轉(zhuǎn)染和融合領(lǐng)域擁有超過二十年的研究經(jīng)驗(yàn)，其代表產(chǎn)品NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)自上市以來受到了國內(nèi)外眾多科學(xué)家的青睞。在干細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面，如iPS、ESC、HSC和MSC等細(xì)胞，NEPA21均被研究者們用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，積累了豐富的轉(zhuǎn)染條件、細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和基因編輯效率等寶貴的經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)。

 

案例一 使用NEPA21電轉(zhuǎn)染儀將mRNA導(dǎo)入hESC

參考文獻(xiàn)：Gene Manipulation of Human Embryonic Stem Cells by In Vitro-Synthesized mRNA for Gene Therapy

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：GFP / DsRed mRNA

電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓125V（文中只寫明電壓，詳細(xì)參數(shù)可來電咨詢）

在本研究中，作者通過體外轉(zhuǎn)錄合成多種類型的mRNA，使用NEPA21電轉(zhuǎn)儀將其導(dǎo)入到hESC中，以研究mRNA在hESC中的轉(zhuǎn)染效率和誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的時(shí)間（圖1）。同時(shí)，為了保證轉(zhuǎn)染效率對HN4細(xì)胞系不具有特異性，作者對多種hESC細(xì)胞系和iPS的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了比較。在電穿孔24h后，F(xiàn)CAS分析顯示，GFP mRNA在HN4、NS1、NS2和iPS中表達(dá)量均在95%以上（圖1）。

圖1 電穿孔24h后，GFP在不同細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效率
 

在電穿孔后，是否能維持胚胎干細(xì)胞的多能性仍需要進(jìn)一步的檢測。在此，研究人員通過免疫熒光法檢測了兩種常見的標(biāo)志基因（Oct4和SSEA4）。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24h后，大多數(shù)表達(dá)GFP的細(xì)胞仍然呈Oct4陽性和SSEA4陽性。
 

圖2 電穿孔24h后，HN4細(xì)胞中Oct4和SSEA4基因的表達(dá)
 

此外，研究人員還證明采用電穿孔法可以有效地將GFP和DsRed mRNA共轉(zhuǎn)染至HN4細(xì)胞中（圖3）。
 

圖2 GFP和DsRed mRNA共轉(zhuǎn)染
 

案例二  使用NEPA21進(jìn)行iPSC電轉(zhuǎn)及基因編輯（CRSIPR/TALENs）

參考文獻(xiàn)：

1.Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9.

2. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR–Cas9 system

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：EGFP質(zhì)粒、敲除實(shí)驗(yàn)（TALENs: 5μg left + 5μg right或CRISPR: 5μg Cas9 + 5μg sgRNA）、敲入實(shí)驗(yàn)（5μg donor vector + TALENs（5μg left + 5μg right）或CRISPR（5μg Cas9 + 5μg sgRNA））

電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓125V、脈沖時(shí)長5ms、脈沖次數(shù)2

為了在iPS細(xì)胞中獲得最高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，研究人員使用EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了3種iPS細(xì)胞系（201B7、404C2、DMD-iPSC），優(yōu)化脈沖電壓、脈沖時(shí)間等轉(zhuǎn)染條件。結(jié)果如下圖所示：

圖4 iPSC轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
 

使用NEPA21優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件之后，通過TALEN和CRISPR兩種方法對iPSC的DMD基因進(jìn)行敲除和敲入實(shí)驗(yàn)，基因編輯效率如下：

Knockout：
 

圖5 iPSC基因敲除效率
 

Knockin：
 

圖6 iPSC基因敲入效率

 

案例三  使用NEPA21進(jìn)行HSC轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化及基因編輯（CRISPR）

參考文獻(xiàn)：Non-viral ex vivo genome-editing in mouse bona fide hematopoietic stem cells with CRISPR/Cas9

轉(zhuǎn)染質(zhì)粒：CRISPR/RNP

電轉(zhuǎn)參數(shù)：穿孔參數(shù)（電壓100V、脈沖時(shí)長5ms、脈沖次數(shù)8）、轉(zhuǎn)移參數(shù)（電壓10V、脈沖時(shí)長50ms、脈沖次數(shù)5），本文使用1mm間隔電轉(zhuǎn)杯

在這項(xiàng)研究中，研究者旨在通過連續(xù)移植來評估真正的HSCs的基因組編輯效率。為了避免病毒整合到HSC基因組中，采用了非病毒轉(zhuǎn)染方法（電穿孔）來編輯小鼠HSC的基因組。首先通過電穿孔將Cas9/RNP轉(zhuǎn)移到體外的HSC中，隨后通過三次細(xì)胞移植來檢驗(yàn)真正的HSC的敲除效率。此外，通過基因插入，還成功地證明了對小鼠HSCs中X-SCID突變的基因校正，從而治愈了小鼠。

研究人員首先以GFP為報(bào)告基因，通過NEPA21在小鼠骨髓系陰性細(xì)胞（Lin^-）中優(yōu)化了電穿孔條件，并通過GFP熒光和7-氨基-放線菌素D（7-AAD）染色檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，在電壓100V、脈沖時(shí)間5ms、脈沖次數(shù)8次的電轉(zhuǎn)條件下，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率>60%，存活率>50%，可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的電穿孔參數(shù)（圖7）。

圖7 HSC轉(zhuǎn)染效率
 

隨后，將針對Itga2b基因外顯子1和2的RNP復(fù)合體電穿孔轉(zhuǎn)染至Lin^-細(xì)胞。在體外培養(yǎng)1~2周后，通過Surveyor實(shí)驗(yàn)檢測到Itga2b外顯子1和2的突變，并且將基因編輯后的Lin^-細(xì)胞通過連續(xù)移植后仍能檢測到15%定點(diǎn)突變效率，證明了基因編輯發(fā)生在真正的HSC中（圖8）。

圖8 在HSC中敲除Itga2b結(jié)果
 

為了恢復(fù)X-SCID小鼠的IL2RG基因功能，研究者采取了基于NHEJ和同源無關(guān)的靶向整合（HITI）的策略，將IL2RG外顯子2-8（HITI-cDNAex2-8）整合到IL2RG的內(nèi)含子1。他們先在NIH3T3細(xì)胞中測試了該方法，通過NEPA21電轉(zhuǎn)儀導(dǎo)入IL2RG內(nèi)含子1的gRNA與Cas9（Cas9/RNP-Il2rgin1），在NIH 3T3細(xì)胞中有效地產(chǎn)生了43.1%的突變。基于此，進(jìn)一步檢測了在Lin^-細(xì)胞中的基因插入效率，通過Surveyor分析和擴(kuò)增序列測定，細(xì)胞基因突變效率為20.2%（圖9）。
 

圖9 在HSC中對IL2RG基因插入結(jié)果
 

本文中提到，Cas9/RNP通過電穿孔到造血干細(xì)胞，可以不使用任何病毒載體，基因編輯技術(shù)為基因位點(diǎn)的特異性修飾提供了可能。非整合病毒如腺病毒或腺相關(guān)病毒（AAV）經(jīng)常被用來傳遞CRISPR/Cas9，但它們會在宿主中激發(fā)對組成性表達(dá)的Cas9的免疫反應(yīng)。相反，Cas9/RNP在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中迅速降解，從而逃避宿主的免疫反應(yīng)，更重要的是，電穿孔與其他傳遞方法相比，產(chǎn)生的脫靶DSB更少。

 

案例四  使用NEPA21電轉(zhuǎn)MSC的最佳條件

參考文獻(xiàn)：電穿孔法轉(zhuǎn)染臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳條件

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：EEV-EGFP質(zhì)粒

電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓150V、脈沖時(shí)長5ms、脈沖間隔50ms、脈沖次數(shù)2

本文采用電穿孔法將質(zhì)粒EEV-EGFP轉(zhuǎn)入華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞（WJ-MSC），并通過流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染率，以探討不同電穿孔條件對WJ-MSC轉(zhuǎn)染效率的影響，確定最佳電轉(zhuǎn)染條件。

研究人員測試了不同電壓（125，130，140，150，170V）、不同脈沖時(shí)間（2.5，5.0，7.5ms）、不同細(xì)胞狀態(tài)（體積分?jǐn)?shù)為20%正常氧、體積分?jǐn)?shù)為5%低氧）對WJ-MSC電轉(zhuǎn)染效率的影響。電穿孔后48h進(jìn)行檢測，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒攜帶EGFP綠色熒光標(biāo)簽，轉(zhuǎn)染成功的WJ-MSC將表達(dá)綠色熒光蛋白，使用流式細(xì)胞儀檢測熒光表達(dá)率。

結(jié)果表明，正常培養(yǎng)的WJ-MSC在電壓150V、脈沖時(shí)長5.0ms、脈沖間隔時(shí)間50ms、脈沖數(shù)2次時(shí)可達(dá)到較高的電轉(zhuǎn)染率。
 

圖10 不同轉(zhuǎn)染條件下WJ-MSC的轉(zhuǎn)染效率
 

總結(jié)

眾所周知，較高的電穿孔條件可以更有效地編輯基因組，但會對細(xì)胞造成較大損傷，而較弱的電轉(zhuǎn)染條件對細(xì)胞更溫和，但細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和編輯效率可能較低。因此，為基因組編輯效率和細(xì)胞活力找到一個(gè)可接受的條件是十分重要的。NEPA21采用獨(dú)特的四步法電轉(zhuǎn)程序，可對細(xì)胞穿孔模式和基因轉(zhuǎn)移模式中的所有參數(shù)進(jìn)行單獨(dú)設(shè)置（電壓、脈沖時(shí)長、脈沖間隔、脈沖次數(shù)和衰減比例），非常有利于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的參數(shù)優(yōu)化，提高轉(zhuǎn)染效率。

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用全新設(shè)計(jì)的電轉(zhuǎn)程序，配合專利的電壓衰減設(shè)計(jì)，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，提高細(xì)胞存活率。操作簡單，電轉(zhuǎn)參數(shù)可見可調(diào)，適用性強(qiáng)。特別適用于難轉(zhuǎn)染的原代免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、外泌體、類器官、活體動物、受精卵及宮內(nèi)胚胎等的轉(zhuǎn)染，已應(yīng)用于眾多著名期刊文獻(xiàn)中，是進(jìn)行細(xì)胞懸浮/貼壁狀態(tài)、活體和離體組織轉(zhuǎn)染的電轉(zhuǎn)系統(tǒng)主流品牌之一。

本文引用的案例均為已發(fā)表文獻(xiàn)，想了解NEPA21更多應(yīng)用案例或?qū)嶒?yàn)細(xì)節(jié)可來電咨詢。

 

參考文獻(xiàn)及鏈接：

1.Li Wang X, Yu L, Ding Y, et al. Gene manipulation of human embryonic stem cells by in vitro-synthesized mRNA for gene therapy[J]. Current Gene Therapy, 2015, 15(4): 428-435.（https://www.researchgate.net/publication/276922586_Gene_Manipulation_of_Human_Embryonic_Stem_Cells_by_In_Vitro-Synthesized_mRNA_for_Gene_Therapy）

2.Li H L, Fujimoto N, Sasakawa N, et al. Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9[J]. Stem cell reports, 2015, 4(1): 143-154.（https://www.cell.com/stem-cell-reports/pdf/S2213-6711(14)00335-X.pdf）

3.Li H L, Gee P, Ishida K, et al. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR–Cas9 system[J]. Methods, 2016, 101: 27-35.（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104620231530133X）

4.Byambaa S, Uosaki H, Ohmori T, et al. Non-viral ex vivo genome-editing in mouse bona fide hematopoietic stem cells with CRISPR/Cas9[J]. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2021, 20: 451-462.（https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/fulltext/S2329-0501(21)00001-2?elqTrackId=1f53a0d0cd5f4ebd83035146680a5eb2）

5.王澤, 李春花, 張寧坤, 等. 電穿孔法轉(zhuǎn)染臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳條件[J]. 中國組織工程研究, 2018, 22(17): 2717.（https://www.cjter.com/CN/10.3969/j.issn.2095-4344.0870）

 

END

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