分子互作動態(tài)分析在探究天然和重組蛋白受體結(jié)合動力學(xué)變化中的應(yīng)用

在漫長而充滿挑戰(zhàn)的藥物研發(fā)過程中，需要通過確定候選藥物對細胞靶點的親和力以及相互作用的動力學(xué)來篩選候選藥物。表面等離子體共振（SPR）、生物膜干涉測量法（BLI）、石英晶體微天平（QCM）和表面聲波（SAW）等多種有標記和無標記的方法被用于對從細胞中提取的或重組表達分離的蛋白進行動力學(xué)研究。這些技術(shù)要求將提純的蛋白質(zhì)固定在傳感器表面，以便測量其與溶液中分析物的相互作用。

不幸的是，異源蛋白的表達和純化很繁瑣，并引入不確定性，如天然構(gòu)象的改變，這可能會改變表達蛋白的結(jié)構(gòu)和行為。此外，由于各種細胞異質(zhì)性因素，如細胞表型、生長周期、膜的剛性、受體的可及性和構(gòu)象以及鄰近蛋白的影響，分離提純蛋白受體的結(jié)合動力學(xué)可能與細胞原位天然受體的結(jié)合動力學(xué)大不相同。天然蛋白受體與分離提純蛋白受體之間的這些生理差異及其對受體功能的潛在影響，使得基于細胞原位的相互作用分析方法更具藥理學(xué)相關(guān)性和生物學(xué)意義。
 

圖1，不同形式的抗HER2抗體與HER2分子結(jié)合示意圖

 有幾種方法可用于測量細胞天然受體的結(jié)合動力學(xué)，如表面等離子體共振顯微鏡（SPRM）、配體示蹤劑（LT）和石英晶體微天平（QCM）。然而，SPRM 是唯一具有單細胞分辨率的技術(shù)，因此能夠直接解決細胞異質(zhì)性問題。這種固有的異質(zhì)性會產(chǎn)生范圍廣泛的結(jié)合相互作用行為，而不能像通常的做法那樣，簡單地將整個細胞群的行為平均處理。

本案例對人表皮生長因子受體 2（HER2）的天然形式和重組形式的結(jié)合動力學(xué)進行了詳細研究和比較。由于各種因素的影響，重組形式和天然形式的 HER2 受體的取向可能不同。圖 1 展示了通過（A）胺基偶聯(lián)固定在葡聚糖基質(zhì)芯片和（B）靜電作用固定在培養(yǎng)皿上的 HER2 重組蛋白。固定化后，重組 HER2（rHER2）受體的結(jié)構(gòu)域 IV 可及性更好。然而，細胞原位天然受體HER2是定向的，結(jié)合結(jié)構(gòu)域 IV 非常靠近(C)活細胞和(D)固定細胞的細胞膜。因此，細胞膜可以通過對抗體施加一定的立體位阻影響相互作用。通過對不同受體方向的觀察，我們可以發(fā)現(xiàn)，提純的重組 HER2 受體固定后，結(jié)合域 IV 比其天然形式更容易接近。

利用 SPRm200 系統(tǒng)研究了抗 HER2 抗體與 SKBR3 細胞原位的 HER2 的結(jié)合動力學(xué)，并與分離提純的 rHER2 的結(jié)合動力學(xué)進行了比較。培養(yǎng) SKBR3 細胞并讓其附著于二分之一的聚賴氨酸涂層傳感器表面（圖 2A）；另一半傳感器表面用作參照區(qū)。進行系列動力學(xué)滴定注射，使細胞先后暴露于6種濃度的anti-HER2-FITC 溶液（1.00、5.00、10.00、20.00 和 50.00 nM）中。

                                  圖2，SPRm200細胞原位分子互作動態(tài)分析系統(tǒng)實驗分析

ImageSPR™ 軟件用于分析 SPRM 傳感圖。圖 2B 顯示了單個感興趣區(qū) (ROI) 的代表性結(jié)合反應(yīng)。對藍色 ROI 中觀察到的結(jié)合反應(yīng)進行分析，以生成圖 2C-E 中的結(jié)合直方圖。對直方圖進行高斯分布擬合，以確定每個動力學(xué)參數(shù)的平均值和 95% 的置信區(qū)間。抗體與天然 HER2 受體之間的結(jié)合相互作用遵循 1:2 結(jié)合模型。這一觀察與先前的研究結(jié)果非常吻合，先前的研究表明赫賽汀與天然和糖基化的 HER2 受體的結(jié)構(gòu)域 IV 的結(jié)合方式為 1:2 結(jié)合，與非糖基化受體的結(jié)合力更強，而與糖基化受體的結(jié)合力更弱。

將從 SKBR3 細胞的天然受體獲得的動力學(xué)相互作用值與從提純、固定的重組受體獲得的值進行了比較。對重組受體rHER2 蛋白的結(jié)合研究是在采用 BI-DirectFlow™ 技術(shù)的五通道 BI-4500A SPR 系統(tǒng)上進行的。rHER2 分子通過胺基偶聯(lián)固定在羧甲基葡聚糖（CM-葡聚糖）傳感器芯片上。

                   圖3，BI-4500A多功能分子互作分析儀實驗分析

由于 rHER2 受體上缺乏糖基化修飾，因此采用更簡單的 1:1 相互作用動力學(xué)模型進行擬合分析（圖 3）。如表 1 所示，與重組受體相比，細胞內(nèi)天然受體的結(jié)合速率較慢。這一點在第二組細胞原位動力學(xué)峰上表現(xiàn)得尤為明顯，這些峰歸因于糖基化，其結(jié)合率慢約 3.5 倍，親和力弱約 17 倍。我們懷疑提純的 rHER2受體固定后的取向和缺乏糖基化阻礙有助于提高 rHER2 受體結(jié)合域 IV 的可及性，從而使抗體結(jié)合速率更快，親和力更強。

                   表1，抗 HER2 抗體與細胞原位HER2和重組 HER2 相互作用測得的動力學(xué)參數(shù)

本案例在細胞原位天然蛋白受體形式和固定重組蛋白受體形式之間觀察到了截然不同的相互作用行為。這些差異凸顯了基于細胞原位的分子互作動力學(xué)研究對藥物開發(fā)的重要性，從而能更全面地評估藥效、生物相關(guān)藥效代動力學(xué)和基本的細胞生物學(xué)過程。

SPRm200系統(tǒng)將光學(xué)顯微鏡與分子互作技術(shù)相結(jié)合，專為觀察和測量細胞膜表面蛋白和其他目標分子結(jié)合親和力及動力學(xué)常數(shù)設(shè)計，為分子相互作用的研究開辟了新的前沿。

(1)SPRm200系統(tǒng)無需對觀察目標進行標記，可以實時定量的進行檢測；

(2)可同時可視化觀察細胞結(jié)構(gòu)和局部結(jié)合活性；

(3)無需提取細胞膜蛋白，即可在正�；罴毎麪顟B(tài)下觀察和測量藥物和膜蛋白的實時相互作用；

(4)探測器測量每個像素的SPR響應(yīng)，并將其映射到SPR圖像中，在每個像素處，記錄一個傳感圖，從而提供更多的局部信息。

SPRM技術(shù)使在自然條件下研究細胞表面膜蛋白與其他目標分子結(jié)合和相互作用成為可能。SPRm200細胞原位分子互作動態(tài)分析系統(tǒng)憑借其卓越的靈敏度和穩(wěn)定性，助力科學(xué)研究新發(fā)現(xiàn)，推動藥物開發(fā)新高度。

參考文獻

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