內(nèi)毒素檢測（重組C因子法）的原理及操作步驟

一，重組C因子法原理

PyroGene™重組因子C試劑盒是一種不含動物制品的LAL替代方案，F(xiàn)DA已許可將其作為一種替代方法。它基于一種重組產(chǎn)生的C因子(rFC)，C因子是馬蹄蟹凝血級聯(lián)反應(yīng)中的第一個組成部分。 它由內(nèi)毒素結(jié)合激活。然后，產(chǎn)生的活性成分發(fā)揮作用，裂解合成底物，釋放熒光。反應(yīng)在96孔板中操作，使用380/440nm的激發(fā)/發(fā)射波長，在時間零點(diǎn)和一小時孵育后，在熒光酶標(biāo)儀中以37°C ± 1°C孵育的時間零點(diǎn)和一小時后，分別測量熒光。
 

比較細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試劑盒中的擴(kuò)增方法

對一小時讀數(shù)和零時讀數(shù)之間的差 (∆RFU)進(jìn)行校正，用于陰性對照 ∆RFU熒光。凈熒光的對數(shù)與內(nèi)毒素濃度的對數(shù)成正比，并且在0.005-5.0 EU/ml范圍內(nèi)呈線性。樣品中內(nèi)毒素的計算與標(biāo)準(zhǔn)曲線有關(guān)。

三，重組C因子法檢測所需主要設(shè)備、材料

試劑

– rFC酶溶液

– 熒光底物

– rFC定緩沖液

– 內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 (CSE)

– LAL 試劑檢查用水（即LRW）(# W50-640, W50-100, W50-500)

器具

– 玻璃稀釋管(# N207)

– 獨(dú)立包裝的血清吸管（選購）

– 標(biāo)簽

– 96-微孔板 (# 25-340)

– 試劑槽(# 00190035)

請使用經(jīng)內(nèi)毒素試驗(yàn)驗(yàn)證合格的無熱原器具。

設(shè)備和軟件

– 八道移液器

– 孵育熒光酶標(biāo)儀

– WinKQCL™軟件

– 移液器

– 計時器

– 漩渦混合器

三，操作步驟

注意事項

– 使用匹配的試劑

– 使用玻璃管制作內(nèi)毒素稀釋液[不推薦使用塑料管]

– 遵循所有關(guān)于內(nèi)毒素漩渦震蕩次數(shù)的建議

– 使用經(jīng)內(nèi)毒素試驗(yàn)驗(yàn)證合格的無熱原器具

– 使用前，先使試劑溫度與室溫保持相同

– 不要旋轉(zhuǎn)工作試劑

– 將試劑放入96-微孔板的孔中時，避免產(chǎn)生氣泡

– 不要污染樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、LRW 和器具

– 應(yīng)正確安裝、驗(yàn)證并維護(hù)設(shè)備儀器