超寬動態(tài)范圍數(shù)字PCR檢測技術(shù)的最新突破：Flodd-PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用

同時，可實現(xiàn)核酸檢測的絕對定量。達普生物研發(fā)團隊全程參與了該技術(shù)的發(fā)明。

數(shù)字 PCR（dPCR）技術(shù)由于其絕對定量的能力和極高的靈敏度，被廣泛的應(yīng)用于分子診斷領(lǐng)域。然而，與目前的金標準定量 PCR （qPCR）相比，dPCR 在動態(tài)范圍方面落后了 3~4 個數(shù)量級，這極大地限制了其在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，對一些載量范圍波動較大的病毒感染樣本進行定量時，高載量的樣本往往會使 dPCR 顯全陽性而無法通過泊松分布定量。因此，亟需開發(fā)一種比目前的 dPCR 動態(tài)范圍更大且簡便易用的新的 dPCR 策略。

近期，上海科技大學(xué)劉一凡課題組與中科院上海微系統(tǒng)所、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院團隊合作開發(fā)了熒光編碼對數(shù)稀釋數(shù)字 PCR 技術(shù)（Flodd-PCR），該方法展示出的動態(tài)范圍為 10⁷，比傳統(tǒng) dPCR 高了逾兩個量級。相關(guān)研究成果以“Fluorescence-coded logarithmic-dilution digital droplet PCR for ultrawide-dynamic-range nucleic acid quantification”為題，發(fā)表在《Biosensors and Bioelectronics》上（DOI：doi.org/10.1016/j.bios.2023.115702）。上�？萍即髮W(xué)物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院劉一凡課題組 2023 屆碩士畢業(yè)生施清源、2021 級博士研究生李婕、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗科劉春辰博士為本文共同第一作者，上�？萍即髮W(xué)劉一凡研究員、中科院微系統(tǒng)研究所羅源副研究員、南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院鄭磊教授為本文通訊作者。數(shù)字PCR設(shè)備（Nebula 全自動數(shù)字PCR系統(tǒng)）和試劑均由達普生物提供。

1. Flodd-PCR 基本工作原理

如圖 1 所示，F(xiàn)lodd-PCR 的基本原理為在一次 dPCR 反應(yīng)中引入四種對數(shù)稀釋的樣本濃度，每種稀釋倍數(shù)分別對應(yīng)一種濃度指示劑熒光強度；在 PCR 后，液滴將被根據(jù)熒光強度拆分成四組，每組分別進行拷貝數(shù)定量。如此以來，一次 Flodd-PCR 實驗約等效于四組進行梯度稀釋的、平行的 dPCR 實驗，從而大幅提高了動態(tài)范圍。

為了實現(xiàn)上述概念，研究團隊首先設(shè)計并開發(fā)了一種微流控芯片，該芯片能夠?qū)崿F(xiàn)對檢測樣本的連續(xù)對數(shù)梯度稀釋（20~1000 倍）和并行液滴生成（圖 2），F(xiàn)lodd-PCR 芯片一共有兩個入口，一個入口通入待檢測的模板 DNA 樣本和熒光指示劑，另一個入口通入 PCR 所需的其他試劑：酶、引物和探針等。上述兩種溶液經(jīng)過連續(xù)梯度稀釋后將生成四組液滴，每組的液滴內(nèi) DNA 模板和熒光指示劑都稀釋到一個特定的濃度，同時又使其他試劑（如引物、探針和聚合酶等）保持在正常工作濃度。在熱循環(huán)后，利用商業(yè)化數(shù)字 PCR 液滴閱讀儀同時讀取 PCR 探針熒光和稀釋指示劑熒光，最終根據(jù)熒光指示劑將混合的液滴分成四個聚類，并分別計算拷貝數(shù)。

圖 1：Flodd-PCR 原理流程圖圖 2：Flodd-PCR 芯片設(shè)計及稀釋性能表征

2. Flodd-PCR 的動態(tài)范圍表現(xiàn)及臨床有效性驗證

接下來，研究團隊通過一系列實驗表征了 Flodd-PCR 的實際動態(tài)范圍，如圖 3 所示。實驗結(jié)果表明常規(guī) dPCR 的動態(tài)范圍僅為 4~40,000 拷貝/µL，而 Flood-PCR 得益于連續(xù)梯度稀釋的功能，能夠?qū)�檢測動態(tài)范圍擴寬到 4~20,000,000 拷貝/µL。此外，團隊還將 Flodd-PCR 和其他的代表性高動態(tài)范圍 dPCR 方法進行了橫向比較，結(jié)果表明 Flodd-PCR 在實現(xiàn)超高動態(tài)范圍的同時并沒有增加液滴的數(shù)量，這意味著 Flodd-PCR 的液滴讀取和傳統(tǒng) dPCR 一樣簡便。

圖 3：Flodd-PCR的動態(tài)范圍標準

最后，為了驗證 Flodd-PCR 在臨床檢測上的實用性，研究團隊將其應(yīng)用于臨床患者樣本中人乳頭狀瘤病毒 HPV（16型）的定量檢測。HPV-16 作為高危病毒類型可以在 70% 的宮頸癌病例中發(fā)現(xiàn)，其病毒載量的動態(tài)區(qū)間可達 10⁷ 以上，遠超出了傳統(tǒng) dPCR 的動態(tài)范圍（約 10⁵）。實驗結(jié)果表明（圖 4），得益于更高的動態(tài)范圍，F(xiàn)lodd-PCR 的定量成功率優(yōu)于 dPCR，其定量結(jié)果也和金標準 qPCR 高度一致。以上結(jié)果表明，F(xiàn)lood-PCR 技術(shù)可以運用到真實的臨床案例中。

綜上所述，F(xiàn)lodd-PCR 是一種新穎的超高動態(tài)范圍的數(shù)字 PCR 技術(shù)，其巧妙地運用了微流控技術(shù)和熒光編解碼策略，實現(xiàn)了多種濃度樣本檢測的“多路復(fù)用”。該技術(shù)對傳染性疾病臨床樣本檢測性能表現(xiàn)優(yōu)異， 如 HPV 檢測， 定量成功率優(yōu)于普通數(shù)字 PCR 系統(tǒng)，且定量結(jié)果和金標準方法保持一致，具有臨床推廣應(yīng)用價值。

圖 4：Flodd-PCR 對臨床 HPV 樣本的高動態(tài)范圍定量