CY5/CY5.5熒光成像效果之物鏡篇
如何提升CY5/CY5.5熒光成像效果之物鏡篇
在之前的系列文章中，我們已經(jīng)給大家介紹過如何從攝像頭、熒光光源、熒光激發(fā)塊幾方面提升CY5/CY5.5的成像效果，今天我們繼續(xù)為大家?guī)�，如何從物鏡層面進行提升。
一、物鏡如何影響CY5/CY5.5熒光成像？
落射熒光顯微成像中，選擇一個合適的物鏡對于良好的熒光顯微成像質(zhì)量有著至關重要的作用。因為落射熒光成像中激發(fā)光和發(fā)射光均要經(jīng)過物鏡，物鏡的熒光通過率會非常影響成像熒光效率，熒光通過率低的物鏡成像信號會更弱，信噪比低。cy5/cy5.5標記的熒光成像信號比一般的弱，因此需要更好的物鏡，一般建議至少需要半復消色差級別的物鏡，這個級別或以上的物鏡，才能有效透過熒光信號，提供高對比度、無背景熒光噪聲的圖像。
落射熒光成像中光要經(jīng)過物鏡兩次
二、如何選擇合適的熒光物鏡
在落射熒光成像中，物鏡既是落射熒光系統(tǒng)的“聚光鏡”，也是利用光線使標本第一次成實像的核心部件，因而直接關系和影響成像的質(zhì)量和各項光學技術(shù)參數(shù)。在cy5/cy5.5熒光顯微成像應用中，想要獲得理想的成像效果，需重點對物鏡以下幾個參數(shù)進行考量。
顯微鏡物鏡標識
（1）數(shù)值孔徑。在物鏡參數(shù)中可用NA表示，一般在倍數(shù)標識后面，在空氣系物鏡中，NA值小于1，油鏡或水鏡可大于1，NA值越大，代表該物鏡分辨率越高，細節(jié)表現(xiàn)越清晰。簡單理解，同樣倍數(shù)的物鏡，數(shù)值孔徑越高，收集光的能力越強，細節(jié)越好。
分辨率越高細節(jié)越清楚
（2）色差矯正能力和場曲。數(shù)值孔徑越高，樣品細節(jié)越清晰，但同時高倍放大下的色差也會更明顯。色差是不同波長的光在同一介質(zhì)中有不同的折射率，在物鏡成像時導致的光學瑕疵，通俗的理解就是圖像有光暈。通過不同透鏡組合設計，可減少或消除色差，根據(jù)對波長矯正覆蓋范圍大小，可分為消色差（ACH）、半復消色差（FL/Semi-APO）、復消色差（APO）物鏡，同樣倍數(shù)物鏡，消色差越強數(shù)值孔徑也越高；不同品牌的同級消色差設計，光譜矯正覆蓋范圍會有不同，大致可參考下圖。
cy5/cy5.5的最大發(fā)射波長一般都在670nm以上，甚至可達700nm，因此低數(shù)值孔徑的消色差物鏡不太好用，使用數(shù)值孔徑更高的半復消色差物鏡和復消色差物鏡效果更好，信號更強，信噪比高，可減少信號附近的色差。
左有色差矯正，右無矯正
另外還有一點是場曲矯正，會影響視場清晰的范圍，有場曲矯正能力的物鏡一般稱為平場物鏡（plan），可矯正透鏡成像導致的圖像畸變，使整個視野都平坦清晰。
無場曲矯正，圖像存在畸變
明美物鏡方案
（1）M-UPlanFLN系列
□高數(shù)值孔徑，分辨率高
□高透光率
（2）PlanFluor系列
□高數(shù)值孔徑，提供高清晰度、高對比度熒光圖像
□熒光成像背景信號更純凈
（3）Apo系列
□平場復消色差物鏡，可對700nm附近的圖像色差進行矯正
□高數(shù)值孔徑，分辨率高
□弱熒光信號下成像清晰
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