原位雜交技術(shù)（ISH）的基本原理及最新進(jìn)展在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用

摘要

1.原位雜交（ISH）是一種廣泛使用的方法，用于定位和定量各種細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)制劑中的DNA或RNA，并保留細(xì)胞和組織的形態(tài)。

2.ISH是一種極其靈活的技術(shù)。事實(shí)上，可以選擇DNA或RNA探針，這些探針可以帶有放射性、熒光或抗原標(biāo)記的堿基，進(jìn)而進(jìn)行顯色（CISH）或熒光檢測（FISH）。

3.該技術(shù)的最新進(jìn)展克服了其主要局限性：靈敏度，尤其是在檢測單拷貝目標(biāo)時。Enzo Life的AMPIVIEW™ RNA探針采用LoopRNA ISH™技術(shù)，是檢測組織和細(xì)胞中核酸靶標(biāo)最靈敏的方法之一，而且不會破壞樣本的形態(tài)。

 

簡介

原位雜交（ISH）是一種廣泛使用的方法，用于定位和定量細(xì)胞學(xué)制備物（中期染色體涂片、細(xì)胞、組織）甚至全胚胎（WMISH）中的DNA或RNA。它的正式誕生可追溯到1969年，當(dāng)時兩個獨(dú)立的研究小組使用體內(nèi)產(chǎn)生的放射性標(biāo)記RNA作為探針，檢測爪蟾卵母細(xì)胞核中的互補(bǔ)DNA（1,2）。第一代探針?biāo)�使用的放射性�?biāo)記技術(shù)看起來很有前途，但由于許多限制因素，如標(biāo)記所使用同位素的半衰期本身較短，或更重要的是與放射性有關(guān)的安全和環(huán)境問題，其應(yīng)用一直相當(dāng)有限。自這些開創(chuàng)性工作以來，分子生物學(xué)技術(shù)的巨大進(jìn)步使ISH越來越實(shí)用，用途也越來越廣泛。如今，ISH已成為一種重要的實(shí)驗(yàn)室工具，常規(guī)應(yīng)用于從基礎(chǔ)研究到臨床診斷和預(yù)后等多個領(lǐng)域。為了實(shí)現(xiàn)這種靈活性，人們可以選擇DNA或RNA探針，它們可以帶有熒光或抗原標(biāo)記的核苷酸。檢測方法是顯色（CISH）還是熒光（FISH），也可根據(jù)所需的分析類型進(jìn)行調(diào)整，其中CISH更適用于分子病理學(xué)診斷，可同時觀察目標(biāo)和標(biāo)本形態(tài)，而FISH通常是多重分析和基因組畸變研究的首選。
 

本綜述將介紹ISH基本原理，該技術(shù)的最新進(jìn)展，并說明這些進(jìn)展如何在個性化醫(yī)療時代進(jìn)一步擴(kuò)大ISH的應(yīng)用范圍。

 

ISH工作原理

具體方案嚴(yán)格取決于樣品類型、研究目的、探針性質(zhì)和所選檢測方法，ISH程序可歸納為幾個要點(diǎn)：

探針生成：在雜交階段作為誘餌使用的探針是與相關(guān)序列互補(bǔ)的DNA或RNA片段。在合成過程中，可以通過加入與標(biāo)記物共軛的核苷酸對其進(jìn)行標(biāo)記。

標(biāo)本制備：將感興趣的細(xì)胞或組織固定保存。組織通常嵌入石蠟并切成薄片。然后將標(biāo)本固定在玻璃載玻片上并進(jìn)行滲透，使探針能接觸到目標(biāo)序列。

變性：樣本中的探針和核酸都會受熱變性，為隨后的雜交階段做好準(zhǔn)備。

雜交（或退火）：包括探針與樣本中的互補(bǔ) DNA/RNA 序列自發(fā)配對。

檢測：探針與其目標(biāo)物之間形成的雜交可以利用不同類型的標(biāo)記進(jìn)行可視化。

如下所述，根據(jù)研究目標(biāo)的不同，需要采用不同的探針類型和檢測方法。

 

探針類型

雜交可以在互補(bǔ)的脫氧核苷酸或核糖核苷酸之間進(jìn)行，因此可以使用DNA或RNA探針來定位特定樣本中的DNA或RNA。然而，這些不同類型的探針并不等同，我們必須為實(shí)驗(yàn)選擇最合適的方案。例如，RNA-RNA雜交探針比RNA-DNA雜交探針更穩(wěn)定，而RNA-DNA雜交探針又比DNA-DNA雜交探針更穩(wěn)定。根據(jù)ISH目標(biāo)的不同，穩(wěn)定性的差異會影響探針性質(zhì)的選擇。
 

DNA探針是含有相關(guān)染色體區(qū)域特異核苷酸序列的DNA片段。其最常見的合成方法之一是切口平移反應(yīng)，分兩步進(jìn)行（圖1A）。首先，用低濃度的DNAse I酶處理模板DNA（通常是細(xì)菌人工染色體[BAC]），使其隨機(jī)缺口，產(chǎn)生一個游離的3′-OH基團(tuán)。在第二步中，DNA聚合酶I將通過5'-3'外切酶活性去除核苷酸，同時拉長3'-OH基團(tuán)，后者將作為引物。然后，反應(yīng)混合物中經(jīng)過修飾的核苷酸將被整合到新合成的鏈中，從而對探針進(jìn)行標(biāo)記。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是合成DNA探針的另一種常用方法：可以在有適當(dāng)標(biāo)記引物的情況下擴(kuò)增感興趣的序列（末端標(biāo)記PCR，圖1B），或者在反應(yīng)混合物中加入標(biāo)記的dNTPs，使反應(yīng)產(chǎn)物在合成過程中被標(biāo)記（連續(xù)標(biāo)記PCR，圖1C）。基于DNA的ISH更常用于檢測細(xì)胞核中的特定DNA序列，例如識別潛在的基因擴(kuò)增、缺失、易位和染色體數(shù)目。
 

RNA探針是一段單鏈RNA，用于通過雜交檢測互補(bǔ)核酸序列的存在。RNA探針可通過體外轉(zhuǎn)錄高效、穩(wěn)定地生成。常用的方法是在兩個方向相反的啟動子之間克隆要轉(zhuǎn)錄的DNA，以便使用適當(dāng)?shù)木酆厦负铣捎辛x或反義RNA。在這種情況下，RNA探針在轉(zhuǎn)錄過程中會通過加入修飾的核苷酸而不斷被標(biāo)記，從而產(chǎn)生標(biāo)記加入度很高的探針（圖1D）。此外，由于RNA探針是由線性化模板合成的，因此所有探針分子的長度都是一致的。與DNA探針相比，RNA探針具有信號更強(qiáng)的優(yōu)勢。然而，由于RNA本身的易變性和易受RNase降解的影響，RNA探針必須與其他任何RNA制劑一樣小心處理。RNA ISH主要用于研究細(xì)胞水平的基因轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)。

 

圖1.DNA探針（A-C）和RNA探針（D）最常用的合成方法。

 

標(biāo)記類型和檢測方法

如前所述，ISH探針是用熒光團(tuán)或抗原修飾的核苷酸標(biāo)記的。這種差異與檢測方法有關(guān)。
 

含熒光團(tuán)的探針可在熒光原位雜交（FISH）中直接進(jìn)行熒光檢測。FISH是一種高靈敏度的技術(shù)，可以使用不同的熒光團(tuán)來觀察同一標(biāo)本上的多個目標(biāo)位點(diǎn)。FISH可用于染色體制圖和計數(shù)，以及檢測結(jié)構(gòu)重排，如易位、倒位、插入和缺失。然而，當(dāng)需要組織形態(tài)學(xué)信息時，F(xiàn)ISH可能會受到限制，因此染色體檢測可能是首選。
 

CISH（顯色原位雜交）通常與間接檢測和使用生物素或地高辛標(biāo)記探針有關(guān)。
 

生物素是放射性標(biāo)記核苷酸的第一個替代物，因?yàn)樗�可以利用其與親和素或鏈霉親和素的高親和力結(jié)合，進(jìn)而與報告酶[堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）]結(jié)合顯色。生物素也可被特異性抗體識別，其下游檢測系統(tǒng)與IHC/IF基本相同。不過，生物素探針標(biāo)記可能會導(dǎo)致染色問題，尤其是在內(nèi)源性大量表達(dá)生物素的組織中，如肝、腎、骨骼肌和心肌等。
 

針對這一問題，與地高辛結(jié)合的探針是一種有效的替代方法。地高辛是一種從洋地黃屬植物中提取的類固醇抗原(3)。由于它只存在于這些植物中，因此避免了生物素可能帶來的背景問題。檢測是通過與抗地高辛抗體特異性結(jié)合進(jìn)行的。此外，地高辛和生物素標(biāo)記還可以在多重檢測中結(jié)合使用，例如，可以同時使用兩種不同的原位探針，或者將顯色I(xiàn)SH與IHC結(jié)合使用。

 

用于單分子可視化的RNA ISH的進(jìn)展

早期診斷和個性化治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的兩大挑戰(zhàn)。因此，DNA、RNA和蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物的定量和定性分析在臨床實(shí)踐中的作用日益突出，為診斷、預(yù)后和治療指導(dǎo)提供了重要信息（4）。基于DNA的ISH和IHC通常應(yīng)用于這一領(lǐng)域，而基于RNA的ISH仍僅限于高表達(dá)基因（如EBER1/2）（4），其主要局限在于該技術(shù)的靈敏度，尤其是在檢測單拷貝目標(biāo)時。例如，通過使用“經(jīng)典”RNA ISH，宮頸陰道涂片中HPV的檢測很容易被漏掉，因?yàn)楦腥就ǔＪ怯蓸?biāo)本中少量細(xì)胞中病毒基因組的單一整合引起的（5）。因此，RT-PCR通常被認(rèn)為是臨床診斷（以及任何研究領(lǐng)域）基因表達(dá)分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗�可以檢測到非常有限的相關(guān)序列。然而，與ISH不同的是，RT-PCR需要將樣本均質(zhì)化以提取DNA/RNA，因此無法提供有關(guān)基因表達(dá)的任何空間信息。
 

為了克服這些局限性，多年來人們不斷改進(jìn)ISH技術(shù)，試圖提高其靈敏度。最常見的方法是通過使用支鏈DNA（bDNA）（4,6）來增強(qiáng)檢測能力，其最普遍的應(yīng)用是使用成對的Z-探針（或雙Z-探針）。如圖2所示，Z-探針由三個元素組成：與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的序列（雜交所必需）、間隔物（連接物）和Z-探針尾部。Z探針與前置放大器序列配對，后者又與多個放大器結(jié)合。最后，幾種標(biāo)記探針（顯色或熒光）附著在放大器分子上的特定位點(diǎn)上(7)。只有當(dāng)兩個Z探針同時與目標(biāo)物退火時，才能進(jìn)行檢測，而信號放大過程可使靈敏度極高，從而確保了該系統(tǒng)的特異性。
 

圖2.成對的Z-探針放大技術(shù)示意圖。

 

盡管這種形式的bDNA技術(shù)有許多明顯的優(yōu)勢，但它的某些方面仍然會構(gòu)成制約。例如，由于擴(kuò)增需要多個步驟，因此程序相當(dāng)長。雜交條件也可能很苛刻，從而改變組織或影響其他標(biāo)記的可視化。最后，它的總體成本較高，較小的實(shí)驗(yàn)室不太容易使用。

 

AMPIVIEW™ RNA探針

Enzo Life自1986年開發(fā)出第一款用于ISH的非放射性HPV探針以來，一直被視為標(biāo)記和檢測領(lǐng)域的先驅(qū)，如今再次推出基于LoopRNA專利技術(shù)的 AMPIVIEW™ RNA探針，為該領(lǐng)域做出進(jìn)一步貢獻(xiàn)。如圖3所示，在LoopRNA ISH探針（LRP）中，與目標(biāo)序列配對的區(qū)域穿插著多個與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的RNA間距片段。這些間隔的設(shè)計使其大部分堿基可以用生物素或地高辛標(biāo)記。當(dāng)這種探針與目標(biāo)序列雜交時，標(biāo)記的間隔區(qū)段就會環(huán)出，然后就能被報告系統(tǒng)識別（5）。由于存在多個生物素或地高辛分子，報告基因很容易通過環(huán)路接觸到這些分子，從而使信號得到強(qiáng)力放大，確保了極高的靈敏度。由于雜交無需經(jīng)過多個擴(kuò)增步驟，因此與上述bDNA系統(tǒng)相比，雜交過程更快、更簡便。此外，AMPIVIEW™探針不需要任何特殊設(shè)備，可用于手動或自動程序。
 

關(guān)于檢測，與標(biāo)準(zhǔn)的ISH檢測一樣，可以是直接或間接檢測。當(dāng)探針用生物素標(biāo)記時，可直接使用與報告酶連接的鏈霉親和素（直接或一步式方案）。在間接（或兩步）方案中，抗生物素或抗地高辛抗體可和即用型POLYVIEW® PLUS AP或 HRP檢測試劑結(jié)合使用，產(chǎn)生高強(qiáng)度顯色，染色清晰。

 

圖 3. AMPIVIEW™ RNA 探針設(shè)計和信號放大方式簡圖。

 

Enzo Life的第一批AMPIVIEW™ RNA探針是針對HPV的。La Rocca博士等人證明，基于LoopRNA技術(shù)的ISH探針可以檢測HPV DNA和RNA，甚至可以檢測到單拷貝基因組整合的HPV。這些結(jié)果與另一種市售的雙Z探針進(jìn)行了比較，表明AMPIVIEW™ RNA探針具有同等或更優(yōu)越的性能(5)。文章還強(qiáng)調(diào)了LoopRNAs 的另一個相關(guān)特性，即可以合成與有義序列（與病毒基因組DNA互補(bǔ)）和反義序列（與基因組DNA和RNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)）相對應(yīng)的探針，以便區(qū)分基因組DNA和病毒主動轉(zhuǎn)錄的RNA。
 

AMPIVIEW™ RNA探針實(shí)際上可以針對任何基因組中的任何基因進(jìn)行設(shè)計。例如，在COVID-19大流行期間，俄亥俄大學(xué)的Nuovo博士使用AMPIVIEW™探針檢測了COVID-19患者不同組織中SARS-CoV-2 RNA的表達(dá)，比較了病毒基因組的存在和四種特征性病毒蛋白（包膜、穗、膜和核帽）的存在（8）。

 

參考文獻(xiàn):

1.Gall JG & Pardue ML. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. PNAS (1969). PMID: 4895535.

2.John HA et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature (1969). PMID: 5799530.

3.FarrellJr RE. Nucleic Acid Probe Technology. RNA Methodologies, Ch 12. (2020). Full Text.

4.Wang F et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn (2012). PMID: 22166544.

5.La Rocca G et al. Recent improvements in in situ hybridization for the detection of HPV infections in clinical samples. WCRJ (2020). Full Text.

6.Player AN et al. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J Histochem Cytochem. (2001). PMID: 11304798.

7.Atout S et al. Evaluation of the Suitability of RNAscope as a Technique to Measure Gene Expression in Clinical Diagnostics: A Systematic Review. Mol Diagn Ther (2022). PMID: 34957535.

8.Nuovo GJ et al. A Standardization Protocol for the In Situ Detection of SARS-CoV2 RNA and Proteins. Appl Immunohistochem Mol Morphol. (2022). PMID: 35175238.