MeRIP-seq等揭示m6A RNA甲基化以ABA依賴性方式調控草莓果實成熟
DNA甲基化等表觀遺傳標記在調控不同成熟階段果實成熟中起著關鍵作用。m6A甲基化已被證明可以調控番茄成熟，但目前尚不清楚 mRNA m6A甲基化是否對不同類型水果的成熟調控具有功能保守性。
2021年6月，中國科學院植物研究所秦國政研究組在《Genome Biology》雜志發(fā)表題為“N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner”的研究論文。 該研究以草莓為研究對象，通過MeRIP-seq和對應的RNA-seq等方法揭示了RNA甲基化修飾（m6A）是調控ABA通路的重要成員，進而影響草莓果實成熟。
標題：N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner（N6-甲基腺苷RNA修飾以ABA依賴性方式調節(jié)草莓果實成熟）
時間：2021-06-03
期刊：Genome Biology
影響因子：IF 12.3/ 1區(qū)
技術平臺：MeRIP-seq（m6A-seq）、RNA-seq、定量RT-PCR、m6A-IP-qPCR、RIP等
研究摘要：
本研究通過MeRIP-seq等分析表明了m6A甲基化在草莓果實成熟過程中是顯著變化。編碼序列（CDS）區(qū)域中的m6A修飾表現(xiàn)出成熟特異性，并靶向穩(wěn)定mRNA，而終止密碼子周圍和3′UTR區(qū)域內的m6A修飾通常與相關mRNA豐度呈負相關。研究人員CDS區(qū)域鑒定了數(shù)千個m6A高甲基化轉錄本，包括脫落酸（abscisic acid，ABA）生物合成和信號通路中的NCED5、ABAR和AREB1轉錄本。本研究證明了甲基轉移酶MTA和MTB對于草莓果實的正常成熟必不可少，且MTA介導的m6A修飾促進NCED5和AREB1的mRNA穩(wěn)定性，同時促進ABAR翻譯。
通過比較不同成熟階段草莓果實的m6A甲基組（m6A methylome），研究人員發(fā)現(xiàn)m6A修飾在草莓果實成熟過程中呈現(xiàn)動態(tài)變化。與番茄果實類似，草莓果實中m6A修飾可富集在終止密碼子和3’ UTR區(qū)域，且與基因表達呈負相關。而與番茄果實不同的是，草莓中m6A修飾還可大量富集于CDS區(qū)域，尤其在成熟啟動以后；該區(qū)域的m6A修飾整體上與基因表達呈正相關。差異m6A甲基組分析表明，ABA合成基因NCED5及信號轉導基因ABAR和AREB1的m6A水平在草莓果實成熟過程中顯著升高；m6A修飾可提高NCED5和AREB1的mRNA穩(wěn)定性，并促進ABAR的翻譯效率。進一步研究顯示，m6A甲基轉移酶MTA和MTB正調控草莓果實成熟，且MTA在NCED5，ABAR和AREB1的m6A修飾中發(fā)揮重要作用。值得一提的是，在番茄果實中，m6A修飾可調節(jié)DNA去甲基酶基因的穩(wěn)定性，而在草莓果實中，DNA去甲基酶基因卻不受m6A調控，說明m6A修飾通過不同的方式影響番茄和草莓果實成熟。
研究結果
（1）m6A甲基化是草莓果實中mRNA的共有表征
（2）m6A分布在草莓果實成熟起始階段表現(xiàn)出顯著變化
（3）m6A甲基化總體上影響草莓果實成熟過程中的mRNA豐度
圖3：草莓果實中m6A修飾與mRNA豐度的相關性分析。
e. 差異m6A peaks值的分布特征（如a和b所示）。UTR，未翻譯區(qū)；CDS，編碼序列。
f. 火山圖顯示a和b中所示的不同m6A peaks轉錄本的表達比率。RS3期與RS1期比較，mRNA水平顯著升高和降低的轉錄本分別用紅色和藍色突出顯示（倍數(shù)變化≥1.5；P值< 0.05）。
g-h. RS1期與S6期果實、RS3與RS1果實的基因表達變化累積分布（g）和基因表達比箱形圖（h）。m6A修飾轉錄本分為三類：高甲基化、低甲基化和非差異轉錄本。
I. 基于RS1和S6階段果實之間的差異m6A peaks分布的基因表達比箱形圖。星號表示顯著差異（***P< 0.001；Wilcoxon試驗）
（4）ABA生物合成和信號通路中的基因在成熟開始時表現(xiàn)出m6A甲基化差異變化
圖4：m6A修飾促進ABA通路中基因的mRNA穩(wěn)定性或翻譯。
g. 用于mRNA穩(wěn)定性分析表達盒的示意圖。將NCED5、ABAR和AREB1基因的野生（WT）或突變（MU）CDS分別克隆到由CaMV 35S啟動子驅動的pCambia2300載體中。使用定點突變試劑盒將m6A-seq中鑒定并通過SELECT驗證的特異性m6A位點（以紅色突出顯示）從腺苷（A）突變?yōu)轼B嘌呤（G）。
h. NCED5、ABAR和AREB1的mRNA穩(wěn)定性分析。野生（WT）或突變（MU）CDS在本氏煙草葉片中表達。在指定的時間點放線菌素D處理后，提取總RNA，并將本氏N.benthamiana ACTIN基因作為內部對照進行定量RT-PCR分析。
i. m6A-IP-qPCR分析顯示野生或突變轉錄本中的相對m6A富集。
j. 翻譯效率分析的簡要工作流程。
k. NCED5、ABAR和AREB1的翻譯效率。翻譯效率表示為多體RNA中mRNA相對于總RNA的豐度比。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（n=3）。星號表示顯著差異（*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；學生t檢驗）
（5）草莓果實中m6A甲基轉移酶表征
（6）m6A甲基轉移酶正調控草莓果實成熟
（7）MTA介導的m6A甲基化調節(jié)編碼翻譯起始因子和延伸因子的基因
圖7：m6A對草莓翻譯起始因子或延伸因子的影響。
（8）MTA在m6A mRNA甲基化過程中發(fā)揮重要作用
圖8：MTA沉默草莓果實中m6A mRNA甲基化組變化。
g. 與對照相比，MTA沉默果實中低甲基化m6A peaks的轉錄本GO富集分析。在agriGO數(shù)據(jù)庫中分析GO富集情況，以及Yekutieli校正P值<0.05
參考文獻：
Zhou L, Tang R, Li X, Tian S, Li B, Qin G. N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner. Genome Biol. 2021 Jun 3;22(1):168. pii: 10.1186/s13059-021-02385-0. doi: 10.1186/s13059-021-02385-0. PubMed PMID: 34078442.
2021年6月，中國科學院植物研究所秦國政研究組在《Genome Biology》雜志發(fā)表題為“N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner”的研究論文。 該研究以草莓為研究對象，通過MeRIP-seq和對應的RNA-seq等方法揭示了RNA甲基化修飾（m6A）是調控ABA通路的重要成員，進而影響草莓果實成熟。
標題：N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner（N6-甲基腺苷RNA修飾以ABA依賴性方式調節(jié)草莓果實成熟）
時間：2021-06-03
期刊：Genome Biology
影響因子：IF 12.3/ 1區(qū)
技術平臺：MeRIP-seq（m6A-seq）、RNA-seq、定量RT-PCR、m6A-IP-qPCR、RIP等
研究摘要：
本研究通過MeRIP-seq等分析表明了m6A甲基化在草莓果實成熟過程中是顯著變化。編碼序列（CDS）區(qū)域中的m6A修飾表現(xiàn)出成熟特異性，并靶向穩(wěn)定mRNA，而終止密碼子周圍和3′UTR區(qū)域內的m6A修飾通常與相關mRNA豐度呈負相關。研究人員CDS區(qū)域鑒定了數(shù)千個m6A高甲基化轉錄本，包括脫落酸（abscisic acid，ABA）生物合成和信號通路中的NCED5、ABAR和AREB1轉錄本。本研究證明了甲基轉移酶MTA和MTB對于草莓果實的正常成熟必不可少，且MTA介導的m6A修飾促進NCED5和AREB1的mRNA穩(wěn)定性，同時促進ABAR翻譯。
通過比較不同成熟階段草莓果實的m6A甲基組（m6A methylome），研究人員發(fā)現(xiàn)m6A修飾在草莓果實成熟過程中呈現(xiàn)動態(tài)變化。與番茄果實類似，草莓果實中m6A修飾可富集在終止密碼子和3’ UTR區(qū)域，且與基因表達呈負相關。而與番茄果實不同的是，草莓中m6A修飾還可大量富集于CDS區(qū)域，尤其在成熟啟動以后；該區(qū)域的m6A修飾整體上與基因表達呈正相關。差異m6A甲基組分析表明，ABA合成基因NCED5及信號轉導基因ABAR和AREB1的m6A水平在草莓果實成熟過程中顯著升高；m6A修飾可提高NCED5和AREB1的mRNA穩(wěn)定性，并促進ABAR的翻譯效率。進一步研究顯示，m6A甲基轉移酶MTA和MTB正調控草莓果實成熟，且MTA在NCED5，ABAR和AREB1的m6A修飾中發(fā)揮重要作用。值得一提的是，在番茄果實中，m6A修飾可調節(jié)DNA去甲基酶基因的穩(wěn)定性，而在草莓果實中，DNA去甲基酶基因卻不受m6A調控，說明m6A修飾通過不同的方式影響番茄和草莓果實成熟。
研究結果
（1）m6A甲基化是草莓果實中mRNA的共有表征
圖1：草莓果實中的表觀轉錄組m6A甲基化。
- 不同發(fā)育階段果實的代表性照片。S6，生長期6；RS1，成熟期1；RS3，成熟期3。比例尺=1cm。
- 維恩圖描繪了在果實三個發(fā)育階段的m6A-seq三個生物學重復的m6A peaks重疊分析。Rep：重復。
- 樣品中不同m6A peaks值的m6A轉錄本百分比
（2）m6A分布在草莓果實成熟起始階段表現(xiàn)出顯著變化
圖2：草莓果實成熟過程中的m6A動態(tài)分布。
- 沿轉錄本分布的m6A peaks宏基因組圖譜。UTR，非翻譯區(qū)；CDS，編碼序列。紅色箭頭表示成熟過程中與起始密碼子相鄰的CDS區(qū)域中m6A分布變化，綠色箭頭表示終止密碼子周圍或3′UTR內m6A分布變化。S6，生長階段6；RS1，成熟階段1；成熟階段3。
（3）m6A甲基化總體上影響草莓果實成熟過程中的mRNA豐度
圖3：草莓果實中m6A修飾與mRNA豐度的相關性分析。
- 火山圖顯示與S6期相比，RS1期果實中的高甲基化（紅色）和低甲基化（藍色）m6A peaks。S6，生長階段6；RS1，成熟階段1。
- 火山圖描繪了與RS1期相比，RS3期果實中的高甲基化（紅色）和低甲基化（藍色）m6A peaks。RS3，成熟階段3。
e. 差異m6A peaks值的分布特征（如a和b所示）。UTR，未翻譯區(qū)；CDS，編碼序列。
f. 火山圖顯示a和b中所示的不同m6A peaks轉錄本的表達比率。RS3期與RS1期比較，mRNA水平顯著升高和降低的轉錄本分別用紅色和藍色突出顯示（倍數(shù)變化≥1.5；P值< 0.05）。
g-h. RS1期與S6期果實、RS3與RS1果實的基因表達變化累積分布（g）和基因表達比箱形圖（h）。m6A修飾轉錄本分為三類：高甲基化、低甲基化和非差異轉錄本。
I. 基于RS1和S6階段果實之間的差異m6A peaks分布的基因表達比箱形圖。星號表示顯著差異（***P< 0.001；Wilcoxon試驗）
（4）ABA生物合成和信號通路中的基因在成熟開始時表現(xiàn)出m6A甲基化差異變化
圖4：m6A修飾促進ABA通路中基因的mRNA穩(wěn)定性或翻譯。
- 植物中兩個關鍵ABA信號通路的簡要模型。
- 綜合基因組瀏覽器（IGB）軌跡顯示m6A reads在9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶5（NCED5）、假定ABA受體（ABAR）和ABA響應元件結合蛋白1（AREB1）轉錄本中的分布。高甲基化m6A peaks（倍數(shù)變化≥1.5；P值< 0.05）通過陰影框表示。S6，生長階段6；RS1，成熟階段1。Rep，重復。
- m6A-seq數(shù)據(jù)中NCED5、ABAR和AREB1的m6A富集分析。
- m6A免疫沉淀（IP）-qPCR驗證m6A富集。
g. 用于mRNA穩(wěn)定性分析表達盒的示意圖。將NCED5、ABAR和AREB1基因的野生（WT）或突變（MU）CDS分別克隆到由CaMV 35S啟動子驅動的pCambia2300載體中。使用定點突變試劑盒將m6A-seq中鑒定并通過SELECT驗證的特異性m6A位點（以紅色突出顯示）從腺苷（A）突變?yōu)轼B嘌呤（G）。
h. NCED5、ABAR和AREB1的mRNA穩(wěn)定性分析。野生（WT）或突變（MU）CDS在本氏煙草葉片中表達。在指定的時間點放線菌素D處理后，提取總RNA，并將本氏N.benthamiana ACTIN基因作為內部對照進行定量RT-PCR分析。
i. m6A-IP-qPCR分析顯示野生或突變轉錄本中的相對m6A富集。
j. 翻譯效率分析的簡要工作流程。
k. NCED5、ABAR和AREB1的翻譯效率。翻譯效率表示為多體RNA中mRNA相對于總RNA的豐度比。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（n=3）。星號表示顯著差異（*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；學生t檢驗）
（5）草莓果實中m6A甲基轉移酶表征
圖5：m6A甲基轉移酶MTA與草莓中的MTB互作。
- 哺乳動物中甲基轉移酶復合體介導的m6A裝置的工作模型。m6A甲基轉移酶METTL3和METTL14以異二聚體的形式互作并作為內部m6A裝置的穩(wěn)定催化核心。
- 真核生物m6A甲基轉移酶的系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育樹由MEGA（5.2版）生成。給出了每個分支1000次重復的Bootstrap值。物種名稱縮寫如下：Hs, Homo sapiens; Ms, Mus musculus; At, Arabidopsis thaliana; Os, Oryza sativa; Zm, Zea mays; Sl, Solanum lycopersicum; Nb, Nicotiana benthamiana; Fa, Fragaria × ananassa; Fve, Fragaria vesca。
- RNA-seq揭示了二倍體林地草莓不同發(fā)育階段m6A甲基轉移酶基因MTA和MTB的轉錄水平。S6，生長階段6；RS1，成熟階段1；成熟階段3。
- 不同發(fā)育階段的八倍體栽培草莓果實的代表性圖像。SG，小綠色；Wt，白色；IR，初始紅色；FR，全紅色。比例尺=1cm。
- 通過定量RT-PCR分析八倍體草莓果實中MTA和MTB的轉錄水平。ACTIN基因被用作內部對照。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（n=3）。星號表示顯著差異（*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；學生t檢驗）。
- Y2H分析揭示了MTA和MTB之間的互作。與GAL4激活結構域（AD）融合的MTA（AD-MTA）和與GAL4結合結構域（BD）融合的MTB（BD-MTB）在酵母中共表達。轉化子在SD/-Leu/-Trp（-LW）上生長，并在含有或不含有X-α-gal的SD/-Leu/-Trp/-His（-LWH）和SD/-Leu-Trp/-His/-Ade（-LWHA）上進一步篩選。
- LCI分析揭示了MTA和MTB之間的互作。與LUC的N末端融合的MTA（MTA nLUC）與MTB或其與LUC C的C末端融合的MT-A70結構域（cLUC MTB或cLUC MTBD）在benthamiana葉片中共表達。
（6）m6A甲基轉移酶正調控草莓果實成熟
圖6：m6A甲基轉移酶正調控草莓果實成熟。
- MTA/MTB RNA干擾（RNAi MTA/RNAi MTB）和過表達（OE-MTA/OE-MTB）果實的成熟表型。用空質粒農業(yè)滲透的草莓果實作為對照。實驗進行三個以上生物學重復的，并給出了具有代表性的結果。比例尺=1 cm。
- 通過定量RT-PCR分析RNAi和過表達果實中MTA和MTB以及兩個重要成熟基因CHS和PG1的轉錄水平。ACTIN基因起內部對照作用。
- LC-MS/MS分析揭示了MTA沉默（RNAi-MTA）或MTA過表達（OE-MTA）果實中整體m6A甲基化水平變化。
- RNA免疫沉淀（RIP）分析揭示了MTA蛋白與NCED5、ABAR和AREB1的轉錄本結合。從表達MTA-eGFP融合蛋白的草莓果實中提取蛋白質-RNA復合體，并用抗GFP單克隆抗體或小鼠IgG（陰性對照）進行免疫沉淀。
（7）MTA介導的m6A甲基化調節(jié)編碼翻譯起始因子和延伸因子的基因
圖7：m6A對草莓翻譯起始因子或延伸因子的影響。
- IGB軌跡顯示編碼翻譯起始因子（EIF2、EIF2B、EIF3A和EIF3C）和延伸因子（EF1A）編碼基因轉錄本中的m6A reads分布。高甲基化m6A peaks（倍數(shù)變化≥1.5；P值< 0.05）與S6階段的果實的比較分析具有顯著差異。S6，生長階段6；RS1，成熟階段1。Rep，重復。
- m6A-seq數(shù)據(jù)中EIF2、EIF2B、EIF3A、EIF3C和EF1A的m6A富集。
- 通過RNA-seq分析EIF2、EIF2B、EIF3A、EIF3C和EF1A的轉錄水平。
- RNA免疫沉淀（RIP）分析揭示了MTA蛋白與EIF2、EIF2B、EIF3A、EIF3C和EF1A的轉錄本結合。
（8）MTA在m6A mRNA甲基化過程中發(fā)揮重要作用
圖8：MTA沉默草莓果實中m6A mRNA甲基化組變化。
- Venn圖描繪了MTA RNAi（RNAi-MTA）和對照的果實的三個生物學重復m6A-seq實驗的m6A peaks重疊分析。
- 火山圖顯示與對照組相比，MTA沉默果實中的高甲基化（紅色）和低甲基化（藍色）m6A peaks。
- b中所示的差異m6A peaks的m6A富集比熱圖。
- b中所顯示的差異m6A peaks的分布特征。UTR，未翻譯區(qū)；CDS，編碼序列。
g. 與對照相比，MTA沉默果實中低甲基化m6A peaks的轉錄本GO富集分析。在agriGO數(shù)據(jù)庫中分析GO富集情況，以及Yekutieli校正P值<0.05
參考文獻：
Zhou L, Tang R, Li X, Tian S, Li B, Qin G. N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner. Genome Biol. 2021 Jun 3;22(1):168. pii: 10.1186/s13059-021-02385-0. doi: 10.1186/s13059-021-02385-0. PubMed PMID: 34078442.
標簽：
RNA甲基化
