內毒素檢測中遇到的常見問題及應對方法

理論與實踐

內毒素檢測實用問答①
 

內毒素檢測在現(xiàn)代生物制品和醫(yī)藥領域中扮演著至關重要的角色，注射類藥物、注射器具，植入醫(yī)療器械等都有相應的質量標準，用以確保產品安全性。然而，在進行內毒素檢測的過程中，許多實驗室和研究人員可能會面臨一系列挑戰(zhàn)和疑惑。
 

從選擇合適的內毒素檢測試劑盒和試劑耗材，到配備必要的儀器設備，每個步驟都需要精心考慮。
 

Lonza作為內毒素檢測領域的專家，今天小編邀請到了技術大佬加菲哥，為大家?guī)�來內毒素檢測問答系列，本系列文章旨在解答您在內毒素檢測中可能遇到的常見問題，提供實用建議，幫助您更好地理解并成功應對內毒素檢測過程中的關鍵問題。
 

無論您是初次接觸內毒素檢測還是希望深入了解此領域的專業(yè)人士，本系列文章將為您提供龍沙有關內毒素檢測方面的獨特見解和實用的建議。

 

1. 如何選擇內毒素檢測試劑盒？

檢測測方法的選擇：如果做范圍定性檢測，可以使用凝膠法試劑盒（如PYROGENT™）。但如果需要定量檢測，凝膠法試劑盒可能就不適合，因為凝膠法檢測一般只能給出小于或大于的結果，其通過對樣品進行多次稀釋，將樣品的EU/ml結果縮小到一個范圍，一般是當作半定量的方法。
 

如需要選擇定量檢測進行內毒素檢測比較適合的是濁度法試劑盒（如PYROGENT™-5000），顯色法試劑盒（如Kinetic-QCL™）和重組C因子方法試劑盒（如PyroGene™）。
 

▲ PYROGENT™-5000動態(tài)濁度LAL試劑盒
 

▲ Kinetic-QCL™ 動態(tài)顯色法LAL試劑盒

 

另外，在樣品放行限度和樣品稀釋需求進行檢測靈敏度考量方面：

· PYROGENT™凝膠法試劑盒靈敏度為0.03、0.06、0.125 和 0.25 EU/mL

· 動態(tài)濁度法PYROGENT™-5000試劑盒靈敏度為0.01EU/mL

· 動態(tài)顯色法Kinetic-QCL™靈敏度為0.005EU/mL

· 重組C因子方法檢測靈敏度為0.005EU/mL。

 

2. 內毒素檢測需要哪些儀器設備？

不同內毒素檢測方法需要使用不同配置的設備。

 

使用PYROGENT™ 凝膠法，則需要37°C 恒溫加熱儀。

 

使用動態(tài)顯色法Kinetic-QCL™或動態(tài)濁度法試劑盒PYROGENT-5000™，則需要光吸收酶標儀和相應軟件。酶標儀還應具有振蕩和37°C恒溫孵育功能，動態(tài)顯色法Kinetic-QCL™需要配置405nm光吸收檢測通道，PYROGENT-5000™試劑盒需要340nm光吸收檢測通道。Lonza Elx808™、Nebula™ MMR、Nebula™ AR均能滿足以上性能要求。
 

▲ Nebula™吸光度酶標儀

 

使用PyroGene™ 重組C因子試劑盒，則需要380nm（激發(fā)波長）/440 nm（發(fā)射波長）濾光片組合熒光酶標儀，Lonza PyroWave™ XM、Nebula™ MMR均能滿足以上性能要求。
 

▲ PyroGene™ 重組因子C試劑盒

 

所有的內毒素檢測試劑盒的使用都需要使用渦旋混勻儀和移液器，以及計時器。

 

此外，推薦搭配內毒素檢測專用軟件WinKQCL™ ，用于內毒素定量檢測。該軟件除了具有常規(guī)的數(shù)據(jù)采集、權限管理、審計追蹤、數(shù)據(jù)完整性、數(shù)字簽名、數(shù)據(jù)分析、報告生成和導出、LIMS/MES等系統(tǒng)對接功能和數(shù)據(jù)備份功能外，還有您所期望的趨勢分析、數(shù)據(jù)安全性和“smart stop”（智能停止）功能，以及審計追蹤條目篩選、一個板子同時運行多個實驗并獨立生成報告的功能。

 

3. 如何查詢內毒素檢測試劑盒的CoA和SDS文件？

所有內毒素檢測產品都可以在Lonza Bioscience | Lonza官網(wǎng)輸入試劑盒貨號和批號進行CoA查詢和SDS下載。

 

4. 為什么建議使用玻璃器皿不建議使用塑料器皿？

塑料表面比玻璃表面對內毒素的吸附力更強。因此，建議制備內毒素對照標準(CSE)稀釋液時使用硼硅酸鹽玻璃稀釋管。某些情況下，某些塑料器皿也可以用于內毒素檢測。

 

總之，玻璃是首選材料，PE（聚乙烯）次之，PP（聚丙烯）再次之，也有客戶反饋還可以使用PET材質器皿。如果需要對樣品進行保存，建議對不同材質容器的進行相應驗證，保證樣品中內毒素在儲存后是否可以回收的。

 

5. 為什么CSE稀釋液配置渦旋過程很重要？

內毒素會粘附在玻璃表面上，可以通過適當?shù)臏u旋來充分溶解和混勻，以保證反應管或微孔板中的溶液具有準確的EU/ml濃度。如說明書所述，稀釋之前，CSE小瓶應劇烈渦旋15分鐘，每次使用CSE時都應重復此操作。標準品梯度稀釋液配制時，建議至少渦旋一分鐘。標準品使用前也建議渦旋CSE稀釋液幾秒鐘以確保均勻度和準確性。

 

6. 為什么要使用匹配的試劑？

首先，是合規(guī)性要求。

 

其次， Lonza的每個LAL鱟試劑批次都使用美國藥典內毒素參考標準品(RSE)EC-6（效價為10000EU/瓶）進行效價測試。然后通過與RSE平行測試，將該LAL鱟試劑批次與我們的工作標準品(CSE)相匹配。該RSE/CSE相關測定確定了該批次CSE與該批次LAL鱟試劑一起使用時的效力，因此需要匹配使用。

 

FDA表示，使用LAL鱟試劑制造商的質量證書使公司不必自己進行RSE/CSE比較。Lonza提供所有檢測方法的試劑盒，并且有匹配的試劑，使內毒素檢測更簡單。

 

7. 如何確定工作標準品(CSE)的效價？

Lonza用于測定CSE效價的方法可在每個匹配試劑盒的CoA中找到。

 

常見方法為：多支CSE稀釋后被當作未知樣品，通過RSE稀釋梯度來進行檢測和計算，單位為EU/ml。對于定量檢測方法，檢測結果在RSE標曲范圍內的多支CSE檢測值進行平均即可得到效價。

 

8. 應該如何配制LAL試劑？
 

請溫柔對待Lonza LAL鱟試劑。復溶后通過輕輕倒置或旋轉小瓶，瓶內試劑會很容易溶解，渦旋或劇烈搖晃復溶后的LAL試劑會產生氣泡。

 

使用前幾分鐘重新配制即可，加入LAL鱟試劑后，切勿渦旋。

 

9. 應該如何準備樣品進行測試？

測試前，需要根據(jù)樣品實際情況進行樣本前處理。大多數(shù)樣品只需要稀釋，使用內毒素檢測試劑盒進行測試即可。

 

可以通過樣品的MVD（最大有效稀釋倍數(shù)）確定樣品的可稀釋倍數(shù)。樣品MVD=內毒素限值(EU/ml)/λ（λ為標準曲線的最低濃度值，對于凝膠凝塊，λ為鱟試劑的標記靈敏度）。樣品稀釋倍數(shù)不能超過MVD，為了保證足夠的安全范圍，建議稀釋倍數(shù)盡量不要超過1/2MVD。

 

如果樣品有蛋白酶干擾并導致假陽性結果，建議對樣品稀釋并70°C加熱5-15分鐘進行熱滅活處理。如需要，可以對滅活樣品進行進一步稀釋后檢測。

 

如果樣品可能含有受β-葡聚糖，建議使用β-葡聚糖阻斷劑(b-G-BlockerTM)。β-葡聚糖可能來自酵母和纖維素材料。鱟試劑測試中可以看到β-葡聚糖常見的稀釋/反應模式：濃縮樣品的陰性響應、稀釋度增加時陽性響應，最高稀釋度時陰性響應。使用動態(tài)檢測法，β-葡聚糖污染的樣品中經常出現(xiàn)協(xié)同增強效應。

 

如果樣品中因含有內毒素結合物而存在抑制，可以嘗試使用分散劑PYROSPERSE™。比如脂質乳化劑，電解質溶液，血清和血漿蛋白樣品也可以使用PYROSPERSE™。

 

10. 樣品合適的pH值是多少？如何調節(jié)pH?

內毒素檢測是一系列的酶促反應過程，最適反應pH值范圍為6-8，因此樣品建議pH為6-8。如果樣品pH值超出此范圍，可以使用緩沖液如Tris Buffer、HCl或NaOH進行調節(jié)。

 

為確保緩沖液不含內毒素，需要在使用前進行檢測，或者選擇商業(yè)化試劑，如Lonza的50 mM Tris Buffer。

 

11. 如冰箱的溫度超出了預設范圍，試劑還可以使用嗎？

這個問題經常被問到，請盡量進行冰箱溫度監(jiān)測，保證溫度正常。

 

內毒素檢測試劑產品的正常儲存溫度為2-8°C。如果試劑沒有復溶的情況下，短時間內的失溫對試劑影響不大，凍干組分很穩(wěn)定。如果遇到該情況，建議對試劑盒進行初始質量測試，以確認該試劑盒性能狀態(tài)。