Sapphire激光掃描成像在Cas13激活新機制可優(yōu)化腺相關病毒治療中應用

CRISPR-Cas系統(tǒng)由于具有高度可編程性和靈活性，被廣泛應用于體內RNA敲降和轉錄調控。然而，Cas13效應物的大尺寸及在激活后的非特異性RNA切割，限制了Cas13系統(tǒng)基于腺相關病毒的的治療應用。

近日，美國萊斯大學在Nature Communication上發(fā)表了題為Structural basis for the activation of a compact CRISPR-Cas13 nuclease的研究文章，報告了一種適合腺相關病毒傳遞的緊湊型Cas13 (Cas13bt3)的詳細生化和結構特征，并對其體內工程化應用進行了有效探索。

1 Cas13bt3活性的生化表征
基于體外RNA切割凝膠試驗（Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)拍攝），作者首先設計了一個帶有30 nt間隔的crRNA，用于檢測Cas13bt3對target RNA和非特異性RNA的活性。Cas13bt3在缺乏crRNA的情況下無活性，而crRNA結合激活Cas13bt3可有效切割122nt的target RNA(T0)(圖1b)。有趣的是，與常規(guī)的cas13表現(xiàn)不同，激活的Cas13bt3復合物（Cas13bt3復合物+crRNA+完全匹配的target RNA(T1)）的旁支切割（collateral cleavage）活性很低，其表現(xiàn)為針對poly-U reporter RNA的外切酶切割模式 (U20，圖1c, f) 。

另一方面，激活的Cas13bt3有效地切割了一個36 nt的ssRNA (ssRNA36)，可能圍繞著ssRNA36中存在的“UUC”序列(補充圖1a, b)。作者隨后設計了一系列短的10 nt ssRNA reporter，每個reporter具有一個核苷酸變異(R1-5，圖1f)。在電泳和熒光分析實驗（基于Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)）中，Cas13bt3可在“UUC”位點有效切割R1底物 (圖1d, e, f，補充圖1c)，但不能切割poly-A10、poly-C10和poly-G10，且U10表現(xiàn)出與poly-U20 reporter RNA相同的低外切酶活性(圖1c，補充圖1d)。

可見，僅具有UC基序的底物才能被激活的Cas13bt3有效切割(圖1g)。

圖1. Cas13bt3切割的生化表征。a. Cas13bt3靶切及旁支切割活性圖。b. 有無crRNA時，Cas13bt3(12.5 ~ 200 nM)靶向切割122nt target RNA (T0)。c, d. 12.5-200 nM活化Cas13bt3復合物旁支切割U20底物(c)和R1底物(d)。e激活的Cas13bt3(50 nM)旁支切割不同序列Reporter RNA (R1-R5)。f. 旁支切割實驗使用的Reporter RNA序列。g. 激活的Cas13bt3(50 nM)旁支切割16種可能組合的Reporter RNA。

Cas13bt3激活對target長度有依賴。將target長度從30nt逐漸降至21nt后，旁支切割活性隨之逐漸降至6%，30nt左右長度的target才能完全激活Cas13bt3。此前報道的Cas13bt3結構可能只是活化的中間態(tài) (Cas13bt3^Int，target長度20nt) 。

2 活化Cas13bt3的冷凍電鏡結構
冷凍電鏡下，Cas13bt3^Act（真正激活態(tài)的Cas13bt3-crRNA-hpRNA三元復合物，target長度30nt，見圖2d）顯示為二裂片結構，REC lobe和NUC lobe分別位于spacer/target dsRNA兩端，由兩個IDL(結構域間連接物)連接。REC lobe位于target 5’端，由Helical1、 Helical2及Lid 構成，用于識別DR (圖2f，補充圖s) 。NUC lobe由HEPN1和HEPN2結構域組成，位于spacer/target dsRNA遠端。與Cas13bt3-crRNA 二元復合物（Cas13bt3^Bin）和Cas13bt3^Int相比，REC lobe和NUC lobe發(fā)生很大的構象變化。REC lobe對齊后，Cas13bt3Act中NUC lobe的質量中心相比于前兩者，分別移動了~40 Å和20 Å，旋轉了34度和19度。HEPN結構域發(fā)生顯著的剛性運動，IDL1和IDL2的構象也發(fā)生了劇烈的變化 (圖3e, f) 。
 

3 spacer/target dsRNA識別的分子基礎
在Cas13bt3Act中，直接的蛋白質- RNA接觸(距離< 3.5 Å)是分散的。在target的5′端，來自Helical1的一個環(huán)與間隔鏈接觸，兩個帶正電的殘基K243和K245在10-11位與間隔鏈相互作用(圖4b)。在target的3‘端，兩個HEPN結構域形成一個裂縫，用于dsRNA結合(圖4a)。HEPN1的殘基K54、K57、R179、K180、R155和R156和HEPN2的殘基R681靠近RNA主干(圖4d) 。此外，Cas13bt3Act中完全拉伸的IDL1與位置11-20附近的spacer/target dsRNA相互作用(圖4c) 。殘基K188、R191、R204、D205和T193的主干位于spacer/target dsRNA的主槽附近(圖4c) 。
 

圖4. Cas13bt3與dsRNA的相互作用。Cas13bt3中的spacer/target dsRNA結合界面。dsRNA 從target RNA 5′-端到3′-端進行編號。b,c. 放大的Helical1環(huán)結構域作用視圖(b), IDL1 (c), HEPN

生化實驗與cas13bt3誘導的RNA敲降實驗均顯示，Cas13bt3對target RNA具有一定的錯配耐受性。

4 Cas13bt3活化的結構基礎及工程應用
作者在活性位點周圍發(fā)現(xiàn)了兩個帶正電荷的patch（patch1和patch2），其在長鏈target RNA結合時經歷了構象轉變(圖5a, b)，可能與HEPN的激活有關。Patch1中K194E、R608E/K609E和K645E的突變幾乎消除了HEPN的切割(圖5c) 。Patch2的R719殘基突變可使活性降低94%(圖5c) ， K748E突變使切割率降低50%(圖5c) 。
 

圖5. Cas13bt3的底物結合面。a. Cas13bt3帶電電位面的兩種視圖。target RNA的可能路徑用綠色虛線表示。b. 核酸酶活性位點周圍的Patch1和Patch2的放大圖。c. WT和突變Cas13bt3在Patch1和Patch2上的旁支切割活性。

為了在體內進行轉錄調控和RNA敲降，需要一個既能有效切割target RNA、又能保持最小非特異性切割的Cas13系統(tǒng)，以減少靶細胞的轉錄組損耗。為此，作者在IDL和帶正電的patch上測試了一系列突變，并進行體外切割凝膠試驗(補充圖9e-h，Sapphire FL激光掃描成像系統(tǒng)拍攝)。結果表明，活性位點附近的帶正電荷的patch可能更有助于非特異性RNA結合，從而導致旁支切割。

隨機誘變篩選顯示，干擾帶正電patch附近的疏水相互作用可能會影響局部折疊和RNA結合。作者在K645附近找到兩個疏水簇，分別在Y643和 Y647附近(圖6a) 。突變后的Y643A幾乎消除了這兩種切割活性，而Y647A顯著降低旁支切割活性至4%（Y647A蛋白濃度高達800nM時為10%）（圖6c），但仍保持70%的靶標切割活性 (圖6b，補充圖9e, f)。也同時進一步驗證了Patch 1對Cas13bt3激活的關鍵作用。

最后，為評估結構突變體(Y643A或Y647A)在哺乳動物細胞中的collateral effect，進行流式細胞術實驗。結果證實(圖6e, f)，合理設計的Cas13bt3 Y647A具有最小的collateral effect，同時保持強大的靶標切割活性，是一種有前途的體內RNA編輯工具和進一步的治療應用。
 

圖6. Cas13bt3的高保真切割工程。a. 殘基K645周圍的兩個疏水簇。b. 突變Cas13bt3歸一化的靶切和旁支切割活性。c. 不同蛋白濃度下WTCas13bt3、Y643A、Y647A旁支切割的代表性凝膠圖。d. 切割活性歸一化，如(c)所示。e. HEK293T細胞中Cas13bt3突變體的靶切及旁支切割。f. e中Cas13bt3突變體相對切割效率的統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。歸一化MFI為相對于dCas13bt3條件的平均熒光強度。

總之，作者通過對Cas13bt3的結構和生化表征研究，揭示了其獨特的靶RNA識別和激活機制，或有助于指導最近發(fā)現(xiàn)的大量結構域相似的新Cas13的研究。作者成功構建了工程化變體，對指導Cas13bt3的體內應用具有重要意義。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41501-5