NanoFCM納米流式檢測(cè)儀在TOP-EVs胞內(nèi)蛋白質(zhì)遞送平臺(tái)開發(fā)研究中的應(yīng)用

細(xì)胞外囊泡 (extracellular vesicles, EVs) 是活細(xì)胞分泌的直徑約30~150 nm的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，因其具備良好的生物相容性、低免疫原性和天然的靶向能力而被視為理想的藥物遞送載體。然而，如何將治療藥物有效裝載至EVs內(nèi)部以及到達(dá)受體細(xì)胞后如何有效釋放是細(xì)胞外囊泡作為治療性載體面臨的首要難題。

目前裝載藥物在EVs內(nèi)部的方法總體可以分為兩大類
01.外部裝載
在分離純化獲得EVs后，通過機(jī)械或化學(xué)手段暫時(shí)打開EVs的膜，使藥物進(jìn)入囊泡中；在早期的推文中，小編報(bào)道過不同的外部載藥策略及效果的對(duì)比（外泌體載藥策略：你選對(duì)了嗎？），基于電穿孔、超聲、擠壓、凍融等物理方法進(jìn)行外源性EVs蛋白裝載，會(huì)一定程度上損害EVs的完整性和蛋白質(zhì)的活性，這無疑會(huì)影響藥物的載量和遞送效率，同時(shí)還會(huì)伴隨操作流程復(fù)雜的問題。

02.內(nèi)源表達(dá)
通過細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)，使蛋白或RNA等藥物被分選進(jìn)入EVs。蛋白藥物通常以共價(jià)連接的形式結(jié)合在EVs膜上且內(nèi)體逃逸能力低，使得內(nèi)源表達(dá)策略用于胞內(nèi)蛋白的遞送充滿挑戰(zhàn)。此前曾有體外實(shí)驗(yàn)報(bào)導(dǎo)EVs介導(dǎo)的藥物遞送到達(dá)靶細(xì)胞的效率不足5%，那么有沒有一種既無損又高效的EVs蛋白負(fù)載和靶向的技術(shù)平臺(tái)呢？

TOP-EVs
荷蘭烏特勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Lei和Sluijter等多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)緊密合作，嘗試探索雷帕霉素相互作用的異二聚體蛋白FK506結(jié)合蛋白 (FKBP12) 和T82L突變體FKB12-雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (FRB) 的潛力。FKBP12通過N-肉豆蔻�；�序列連接到細(xì)胞膜上，F(xiàn)RB則通過GGSGG接頭與靶蛋白融合，通過在EV表面修飾融合性水皰性口炎病毒糖蛋白 (vesicular stomatitis virus glycoprotein, VSV-G) 進(jìn)一步促進(jìn)EV在受體細(xì)胞中的內(nèi)體逃逸，以提升胞內(nèi)蛋白的遞送。該藥物遞送平臺(tái)被命名為TOP-EVs (technology of protein loading through extracellular vesicles, TOP-EVs) , TOP-EVs在體外和體內(nèi)條件下均可有效地介導(dǎo)多種靶蛋白的胞內(nèi)傳遞，有望用于推進(jìn)蛋白質(zhì)治療藥物的發(fā)展。該成果以題名"TOP-EVs: Technology of Protein delivery through Extracellular Vesicles is a versatile platform for intracellular protein delivery" 發(fā)表在Journal of Controlled Release上。
 

圖1. TOP-EVs技術(shù)平臺(tái)示意圖

補(bǔ)充：雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，最早是從復(fù)活節(jié)島土壤中的鏈霉菌中分離出來，被發(fā)現(xiàn)具有抗真菌作用，之后被發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制功能。FKBP12 (FK506 binding protein 12) 是能與大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑FK506和雷帕霉素特異性結(jié)合，并在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)的一類蛋白。

TOP-EVs技術(shù)平臺(tái)
為了實(shí)現(xiàn)可控同時(shí)可逆的蛋白裝載及隨后通過EVs的遞送，作者整合了融合源性VSV-G和雷帕霉素誘導(dǎo)的異源二聚體T82L突變體FRB (DmrC) 與FKBP12 (DmrA) 融合的靶蛋白。選取GFP蛋白作為模型，作者首先構(gòu)建了GFP TOP-EVs穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，將其暴露在雷帕霉素（配體）環(huán)境中，通過共聚焦熒光顯微鏡確認(rèn)，孵育24 h后GFP已遷移到細(xì)胞核外。隨后再探索這個(gè)策略能否將GFP有效裝載到EVs中。通過在HEK293FT細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)GFP TOP-EV質(zhì)粒，結(jié)合VSV-G共轉(zhuǎn)染構(gòu)建了TOP-EVs細(xì)胞系（供體細(xì)胞）。隨后加入配體，換成無外泌體培養(yǎng)基，通過差速超速離心的方法分離獲得EV樣品，首先用WB分析定性和（半）定量地驗(yàn)證GFP蛋白的表達(dá)情況（圖2）。

作者設(shè)置了一系列的對(duì)照條件（表1）來確認(rèn)配體和VSV-G是不是TOP-EV平臺(tái)實(shí)現(xiàn)蛋白裝載和遞送的必要條件。從WB的結(jié)果可以判斷，在不添加VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的情況下，供體細(xì)胞與配體共孵育并不會(huì)顯著提升GFP的裝載量。然而，當(dāng)供體細(xì)胞與VSV-G共轉(zhuǎn)染同時(shí)與配體共同孵育時(shí)，GFP在EVs的裝載量得到顯著提升。這個(gè)結(jié)果提示VSV-G質(zhì)粒和配體都是GFP裝載不可或缺的條件。

表1. TOP-EV平臺(tái)不同處理方法（＋表示添加，－表示未添加）
圖2. 通過WB定性和（半）定量驗(yàn)證GFP的表達(dá)情況

NanoFCM研究GFP裝載效率
這些GFP在所有的EVs中是均勻分布的嗎？還是僅在某些EV亞群中過表達(dá)？這個(gè)問題就需要通過單顆粒的手段來解答了。

作者用納米流式檢測(cè)儀進(jìn)一步考察了TOP-EVs平臺(tái)對(duì)GFP的裝載效率，如圖3A所示，在未添加VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)，不管是否加入配體，負(fù)載GFP的EVs顆粒濃度均較低；添加VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染之后裝載GFP的EVs顆粒濃度明顯升高，配體和VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染同時(shí)發(fā)生的情況下GFP裝載效率達(dá)到66.2%（表2），這與WB的結(jié)果一致。采用EVs膜染料MemGlow 640對(duì)四種條件下獲得的TOP-EVs進(jìn)行染色，納米流式檢測(cè)確認(rèn)總顆粒濃度和膜染料陽性的顆粒濃度很接近，證明TOP-EVs的純度非常高。GFP陽性群體和GFP-膜染料雙陽群體的濃度幾乎相同，說明選用的膜染料MemGlow 640對(duì)EVs的標(biāo)記效率非常高，可以有效標(biāo)記含有膜結(jié)構(gòu)的顆粒。

此外，GFP陽性群體中含四跨膜蛋白 (CD9/63/81) 的TOP-EVs從11.3% (-/+：配體/VSV-G) 提高到18.6% (+/+：配體/VSV-G) ，GFP陽性率顯著高于CD9/63/81的陽性率，表明大部分TOP-EVs是不表達(dá)四跨膜蛋白的。從粒徑分布圖中發(fā)現(xiàn)GFP陽性顆粒（綠色）的平均粒徑整體大于GFP陰性顆粒（藍(lán)色）的平均粒徑（圖3D），且TOP-EV (+/+：配體/VSV-G) 的GFP陽性率顯著高于TOP-EV (-/+：配體/VSV-G) ，使用納米流式可以快速揭示EVs粒徑大小和功能之間的相互關(guān)系。至此可以得出結(jié)論，VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和配體誘導(dǎo)的相互作用是促進(jìn)內(nèi)源性TOP-EVs蛋白裝載和傳遞的基本條件。

圖3. 納米流式對(duì)不同培養(yǎng)條件下TOP-EVs內(nèi)的GFP裝載情況分析

表2. NanoFCM分析GFP裝載效率

細(xì)胞水平驗(yàn)證TOP-EVs的GFP傳遞效率
本研究中，TOP-EVs是由HEK293FT細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的，作者設(shè)計(jì)了一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了TOP-EVs傳遞蛋白的能力來源于直接胞內(nèi)蛋白遞送而不是質(zhì)粒污染。作者選用多西環(huán)素 (doxycycline, Dox) 誘導(dǎo)的野生型GFP構(gòu)建體，在Dox存在的情況下，構(gòu)建體中TRE3G反式激活因子的表達(dá)可以促進(jìn)GFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)。如圖4B所示，作者設(shè)計(jì)了16種不同的EVs處理策略，24 h后，熒光顯微鏡下觀察到僅GFP TOP-EVs處理的受體細(xì)胞中觀察到GFP的存在，TOP-EV (+/+：配體/VSV-G) 的GFP熒光亮度最強(qiáng)，用Dox培養(yǎng)且由Dox誘導(dǎo)的野生型GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的EVs處理的受體細(xì)胞中未檢測(cè)到GFP（圖4C）。這一結(jié)果驗(yàn)證了作者先前的假設(shè)，即TOP-EVs對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)遞送的促進(jìn)作用，并不是由于分離過程中的質(zhì)粒污染或?qū)①|(zhì)粒直接裝載到EVs中導(dǎo)致的。

圖4. 細(xì)胞水平驗(yàn)證TOP-EVs介導(dǎo)的GFP蛋白傳遞有效性

TOP-EVs普適性研究
為了證明TOP-EVs遞送平臺(tái)的普適性，作者還拓展了體外條件下TOP-EVs平臺(tái)對(duì)于Cre重組蛋白酶、CRISPR/Cas9核糖核蛋白復(fù)合物 (RNP) 等靶蛋白的遞送能力，同時(shí)驗(yàn)證配體/VSV-G對(duì)TOP-EVs介導(dǎo)的胞內(nèi)蛋白傳遞的重要性。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)TOP-EVs可以在體內(nèi)成功介導(dǎo)肝臟中的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)遞送。

綜上，研究者開發(fā)了一種在體內(nèi)和體外實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性蛋白有效裝載和介導(dǎo)各種靶蛋白的功能性胞內(nèi)遞送的多功能平臺(tái)，在基因編輯領(lǐng)域也有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力

NanoFCM小結(jié)
在該研究中，作者基于納米流式檢測(cè)儀卓越的散射光和熒光檢測(cè)性能，結(jié)合不同的標(biāo)記策略，建立了單外泌體水平不同類型蛋白 (GFP、四跨膜蛋白(CD9/63/81) )以及膜結(jié)構(gòu)的標(biāo)記、檢測(cè)和分析方法，納米流式檢測(cè)技術(shù)在整個(gè)TOP-EVs平臺(tái)的開發(fā)和驗(yàn)證過程中起到關(guān)鍵的作用。我們期待文章的作者們能夠更進(jìn)一步，將TOP-EVs平臺(tái)拓展到更多類型的蛋白，并向產(chǎn)業(yè)化邁進(jìn)。