腫瘤微環(huán)境模擬技術(shù)AVATAR在CAR-T療法征服實(shí)體瘤治療的應(yīng)用

嵌合抗原受體（CAR-T）細(xì)胞療法在治療包括實(shí)體瘤在內(nèi)的各種癌癥方面具有很大的前景。但是科學(xué)家也發(fā)現(xiàn)，對(duì)CAR-T治療血癌和實(shí)體瘤的行為以及有效性進(jìn)行建模一直具有挑戰(zhàn)性，這是因?yàn)榘┘?xì)胞具有獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境（TME）的特征通常為缺氧、酸度增加和高間質(zhì)液壓，這使癌癥細(xì)胞能夠有效逃避免疫監(jiān)測(cè)。這種免疫抑制性TME也會(huì)導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞耗竭，從而限制其抗腫瘤活性和功能。

圖1.AVATAR模擬細(xì)胞腫瘤微環(huán)境

 

為了解決這些問(wèn)題，我們開(kāi)發(fā)了一種新的基于細(xì)胞的檢測(cè)方法，在三維（3D）體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、人類急性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病小鼠模型和免疫抑制腫瘤微環(huán)境中測(cè)量CAR-T細(xì)胞的效力和細(xì)胞毒性功能。利用這個(gè)獨(dú)特設(shè)計(jì)的體外培養(yǎng)系統(tǒng)（AVATAR），我們?cè)佻F(xiàn)了在脈管系統(tǒng)、骨髓和實(shí)體瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的氧氣和間質(zhì)流體壓力，然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和電阻抗等技術(shù)分析細(xì)胞耗竭進(jìn)而測(cè)定在這些環(huán)境下的腫瘤細(xì)胞溶解，并通過(guò)進(jìn)行一系列腫瘤激發(fā)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)了CAR-T抗腫瘤的活力和有效性。

圖2.使用AVATAR提供加壓TME培養(yǎng)條件

 

結(jié)果展示

1.加壓TME條件增強(qiáng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加CD19 CAR-T+細(xì)胞總數(shù)

用CD19-CAR慢病毒轉(zhuǎn)染活化的T細(xì)胞，并在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱或AVTAR培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。在AVTAR系統(tǒng)中生長(zhǎng)的細(xì)胞顯示出5-7%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率增加以及20%的生長(zhǎng)能力增加。

圖3.CD19-CAR-T細(xì)胞的特性

 

2.TME條件提高了CAR-T擴(kuò)增率，增加了CD19 CAR-T+細(xì)胞的總數(shù)

將相同數(shù)量的CD19-CAR-T細(xì)胞（5.0E+05）在不同的O2%和壓力條件下培養(yǎng)11天，并用AO/PI方法每天計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，在低壓/缺氧條件下（CAR-T 15%O2+0 PSI）的AVATAR培養(yǎng)箱中的細(xì)胞具有最高的生長(zhǎng)速率。

圖4.CD19-CAR-T細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

 

3.靶向腫瘤殺傷試驗(yàn)中加壓TME條件提高CD19-CAR-T的存活率

CAR-T細(xì)胞與靶細(xì)胞（NALM6或MV-4-11，5.0E+04/孔）以不同的E:T比共培養(yǎng)20h，然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞毒性，收集細(xì)胞上清液進(jìn)行IFN-γ定量。與正常培養(yǎng)箱相比，在AVATAR培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞具有更高的靶細(xì)胞殺傷能力，但在這些組中未檢測(cè)到IFN-γ分泌的變化。

圖5.CD19-CAR-T殺傷試驗(yàn)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子結(jié)果

 

4.靶向腫瘤殺傷試驗(yàn)中加壓TME條件維持CD19 CAR-T的效力

CD19 CAR-T細(xì)胞在Normoxic（21%O2+0PSI）或TME（AVTAR:1%O2+2PSI）培養(yǎng)條件下擴(kuò)增。CD19 CAR-T細(xì)胞對(duì)NALM6的殺傷是在Normoxic或TME條件下進(jìn)行的。與ST162供體來(lái)源的CD19 CAR-T細(xì)胞相比，ST164供體來(lái)源的CD19 CAR-T細(xì)胞顯示出10%的細(xì)胞毒性增加。供體來(lái)源的CAR -Ts在CD4/8人群中表現(xiàn)出顯著的變化，向CD4人群傾斜。有趣的是，更高的E:T比率并沒(méi)有導(dǎo)致更多的目標(biāo)殺傷。

圖6.在共培養(yǎng)中CD19 CAR-T特異性殺傷NALM6細(xì)胞

 

5.在一系列腫瘤激發(fā)試驗(yàn)中加壓TME條件增強(qiáng)ROR1 CAR-T效力

圖7.一系列腫瘤激發(fā)試驗(yàn)中不同TME條件下ROR1 CAR-T的效力

 

6.免疫抑制TME篩選條件下加壓TME條件增強(qiáng)ROR1 CAR-T效力

腫瘤細(xì)胞溶解測(cè)定：將靶細(xì)胞SKOV3（ATCC）以每孔5K個(gè)細(xì)胞（96孔形式）接種。在效應(yīng)細(xì)胞（ROR1 CAR-T細(xì)胞）以10∶1的效靶比（50K）引入之前，使靶細(xì)胞粘附24小時(shí)。在Normoxia（21%O2&0pSI）或TME（1%O2&2PSI）下進(jìn)行細(xì)胞殺傷測(cè)定。在CO2培養(yǎng)箱或AVTAR系統(tǒng)（環(huán)境O2+4PSI）中轉(zhuǎn)導(dǎo)ROR1 CAR-T細(xì)胞并擴(kuò)增9天。在共培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行IFN-γ分泌測(cè)定（BD cat#555142）。使用BD Fortessa X-20對(duì)Naïve cells（CCR7+CD45RA+）、中央記憶（CCR7+CD45RA-）、效應(yīng)記憶（CCF7-CD45RA-）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

圖8.腫瘤細(xì)胞溶解測(cè)定

 

我們使用靶向卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV3的抗受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（ROR1）CAR-T細(xì)胞進(jìn)行了概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。CD19 CAR-T被用來(lái)靶向急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系NALM6。我們?cè)u(píng)估了效應(yīng)T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的特定比例，以模擬體外CAR-T的效力，并且通過(guò)效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的比率的增加證實(shí)了CD19 CAR-T介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的升高。這些篩選實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果顯示，在TME條件下，ROR1 CAR-T介導(dǎo)的細(xì)胞毒性顯著下降，CD19 CAR-T表現(xiàn)出有效的細(xì)胞殺傷力。我們還發(fā)現(xiàn)了有趣的一點(diǎn)，在高壓和低氧培養(yǎng)（AVTAR）條件下，ROR1 CAR-T細(xì)胞效力水平明顯提高，這值得進(jìn)一步研究。

 

關(guān)于AVATAR

個(gè)體化細(xì)胞控制系統(tǒng)AVATAR可以自由控制培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣含量和壓力強(qiáng)度，在體外精準(zhǔn)模擬出加壓和缺氧的腫瘤微環(huán)境條件，使研究人員能夠在接近真實(shí)的環(huán)境中研究藥物作用機(jī)制、評(píng)估治療效果，得到更加科學(xué)的結(jié)果，同時(shí)也減少項(xiàng)目的優(yōu)化時(shí)間與成本費(fèi)用。