實驗方案:微滴制備儀制備海藻酸鈉微球(Ca-EDTA/HAc法)

實驗目的：

本實驗方案利用微滴/微球制備儀，以Drop-Surf微滴生成油為油相，以含有螯合物Ca-EDTA和海藻酸鈉的溶液為水相制備微液滴，將其接收至含有乙酸的油相中固化制備得到高單分散的海藻酸鈉凝膠微球(CV<5%)。

引言：

水凝膠是一類重要的軟性材料，被廣泛應用于藥物研究、藥物遞送、組織工程和食品科學等領(lǐng)域。在眾多制備水凝膠的天然高分材料中，海藻酸鹽作為一種天然多糖，由于其低毒性、溫和的離子交聯(lián)條件、良好的生物相容性和生物可降解性等優(yōu)點，在生物醫(yī)學領(lǐng)域得到*大的關(guān)注[1]。

微米大小的海藻酸鹽微凝膠球在藥物研究、組織工程和再生醫(yī)學中常被用于包裹活細胞。這種微凝膠球?qū)⒓毎�分散在獨立的區(qū)域內(nèi)為細胞代謝的研究提供了一種有效的策略[2]。納升至皮升的微球可作為獨立的反應器，用于以定量單細胞的方式監(jiān)測、培養(yǎng)或操縱細胞。由于海藻酸鹽與細胞外基質(zhì)具有內(nèi)在的結(jié)構(gòu)相似性，這使得營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣有效的被包裹的細胞攝取[3]。因此，海藻酸鹽凝膠微球已被廣泛用于哺乳動物細胞培養(yǎng)和組織工程的模型系統(tǒng)，即器管(或組織)衰竭時的器管(或組織)替代品[4]。此外，由于細胞間的距離和結(jié)構(gòu)排列對細胞的性質(zhì)和功能有顯著的影響，因此，微球大小和尺寸分布的精確控制至關(guān)重要[5]。

采用液滴微流控技術(shù)可以生產(chǎn)形狀精確可控和粒徑均一的海藻酸鹽凝膠微球。通常，海藻酸鹽溶液在液滴微流控芯片中乳化并分散在油相中，隨后與Ca2+進行交聯(lián)。而這種快速的交聯(lián)反應很可能導致液滴生成粒徑不均和微流控芯片的堵塞。因此，采用液滴微流控制備時需將液滴生成與凝膠化反應分開。例如，張等通過將CaCO3納米顆粒分散于海藻酸鹽水溶液中，然后將生成后的液滴暴露在酸性條件下，導致CaCO3的溶解釋放Ca2+，并使其與海藻酸鹽交聯(lián)凝膠化[6]。然而，由于CaCO3呈顆粒狀，pH降低導致Ca2+的釋放分布不均，進而使得離子交聯(lián)均勻性較差。此外，納米顆粒的團聚也會導致微流控芯片流道的堵塞。

基于以上問題，F(xiàn)luidiclab微滴制備平臺借鑒Utech等人研究運用液滴微流控技術(shù)[7]，以Drop-Surf微滴生成油為油相，以含有螯合物Ca-EDTA和海藻酸鈉的溶液為水相制備微液滴，將其接收至含有乙酸的液油相中固化制備得到高單分散的海藻酸鈉凝膠微球(CV<5%)。其主要原理如下圖所示，H+和EDTA結(jié)合釋放出Ca2+，Ca2+和海藻酸鹽交聯(lián)發(fā)生凝膠反應，*終得到海藻酸鹽微球。該法操作簡便，樣品利用率高，制備得到的微球單分散性高，具有較好重復性。

海藻酸鈉凝膠化機理圖

實驗材料：

試劑	微滴生成油 (Drop-Surf，F(xiàn)luidicLab)
	破乳劑 (Drop-Surf，F(xiàn)luidicLab)
	海藻酸鈉 (FluidicLab)
	冰乙酸 (Macklin, A801295-500 mL)
	無水氯化鈣 (General-Reagent, P1902809)
	0.5 M EDTA (Macklin, E885215-1L)
	氫氧化鈉 (Macklin, S817971-500 G)
耗材	15 mL離心管(Falcon 15 mL REF 352097)若干
	1.5 mL離心管若干
	內(nèi)/外徑0.25 /1.6 mm PEEK管及所需接頭
	10 mL和20 mL透明玻璃瓶若干
	0.22 μm針式過濾器(PTFE材質(zhì))若干
	10 mL注射器若干
芯片夾具	PDMS-FF-100 μm 芯片（FluidicLab）
	PDMS標準芯片夾具
設(shè)備	Fluidiclab微滴/微球制備儀(兩通道)
輔助設(shè)備	快速離心機(湖南湘儀, H1850)
	梅特勒托利多pH計(標準版)、普通光學顯微鏡（用于測微球粒徑）

實驗步驟：
一、 試劑配制：
1、2 M CaCl2 溶液配制：

取2.2197 g的無水CaCl2 (MCaCl2=110.984 g/moL)加入超純水振蕩溶解，*終定容至10 mL備用。

2、 2 % (wt%)海藻酸鈉溶液配制：

取0.2 g的海藻酸鈉固體粉末加入超純水超聲振蕩，60 ℃加熱輔助溶解，*終定容至10 mL備用。

3、 2 M NaOH溶液配制

取1.6 g的NaOH(MNaOH=176.17 g/moL)加入超純水振蕩溶解，*終定容至20 mL備用。

4、 240 mM Ca-EDTA溶液(pH=7.2)配制

分別取1.2 mL的2 M CaCl2，4.8 mL的0.5 M EDTA，加入2 M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2，*終定容至10 mL備用。

【注】下表加入體積供參考，實際加入量以pH值變化為準。

5、水相溶液配制 (1% 海藻酸鈉，120 mM Ca-EDTA)

取等體積240 mM Ca-EDTA溶液與2%海藻酸鈉溶液振蕩均勻得到水相溶液，用0.22 μm針式過濾器過濾備用。

6、 1% 醋酸油相溶液配制 (pH=4.8)

取500 μL微滴生成油，加入體積為5 μL的冰乙酸，振蕩均勻備用。

二、 微滴制備：
1. 微滴/微球制備儀的安裝連接

微滴/微球制備儀安裝連接參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“2. 微滴/微球制備儀的安裝連接”的部分；其連接如下(步驟③-⑦連接效果如下圖所示)：

① 用氣管依次連接“空氣壓縮機”–“氣源處理裝置”–“微滴/微球制備儀”；

② 將微滴/微球制備儀分別與電源、電腦的連接；

③ 用氣管分別將A0(壓力輸出通道一)和A1(油相15 mL儲液池)，B0(壓力輸出通道二)和B1(水相1.5 mL儲液池)連接；

④ 用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A1(油相15 mL儲液池)和A2(通道一流量傳感器)，B1(水相1.5 mL儲液池)和B2(通道二流量傳感器)連接；

⑤ 用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A2(通道一流量傳感器)和A3(PDMS芯片的油相入口)，B2(通道二流量傳感器)和B3(PDMS芯片的水相入口)連接；

⑥ C為標準PDMS芯片和夾具的組合，芯片和夾具的入口通過硅膠塞密封；

⑦ 用PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)將芯片出口D處生成的乳液導出。

2. FluidicLabSuite軟件的安裝和設(shè)備的添加：

FluidicLabSuite軟件的安裝參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite軟件的安裝”的部分；

3. 海藻酸鈉微液滴的制備：

具體操作步驟如下：

① 分別在15 mL油相儲液池(通道一)和1.5 mL水相儲液池(通道二)中依次加入5 mL微滴生成油和1 mL 配制好的水相溶液；

② FluidicLabSuite軟件的設(shè)備添加參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“3.2 FluidicLabSuite軟件的設(shè)備添加”的部分(相機和流量傳感器僅需添加一次)；

③ 打開空氣壓縮機和氣源處理裝置開關(guān)；

④ 在乳液出口端放置離心管接收微滴穩(wěn)定前的廢液；

⑤ 在電腦端設(shè)置通道一壓力(油相，如150 mbar)和通道二壓力(水相，如900 mbar，水相黏度大，流阻大，壓力更大)排出管路和芯片中的空氣；

⑥ 待管路和芯片中完全填充液體后(空氣被完全排出)；將整個系統(tǒng)由壓力控制切換到流速控制，并設(shè)置通道一(油相)和通道二(水相)流速分別為15和8 μL/min；

⑦ 調(diào)整反饋值(Feedback)快速達到設(shè)定流速，并實現(xiàn)流速的穩(wěn)定輸出；

⑧ 用疏水培養(yǎng)皿接收一滴乳液，并在普通光學顯微鏡下觀察其微滴的均勻性；

⑨ 待微滴生成均勻后，即可開始接收至裝有1%醋酸油相溶液的1.5 mL離心管中；

⑩ 20 min后停止收集，密封于離心管中，輕微振蕩加快微滴固化，隨后靜置一段時間。

三. 海藻酸鈉微球的破乳清洗：

具體操作步驟如下：

① 取出1.5 mL離心管底部微滴生成油；

② 按V球：V破=1:2 加入破乳劑，振蕩破乳；

③ 2500 rpm離心處理1 min，并取出底部破乳劑；

④ 重復上述②和③操作；

⑤ *終得到固化后的海藻酸鈉微球，分散在PBS緩沖液中。

四、 微滴/微球制備儀清洗：

微滴生成儀每次使用完必須清洗管路、流量傳感器和芯片。

具體操作詳見“微滴/微球制備儀操作指導卡”。

結(jié)果與討論：

剛接收的微滴平均粒徑為111.04 μm，具有*高的單分散性(變異系數(shù):CV=2.01%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：

*終獲得的海藻酸鈉微球平均粒徑為107.86 μm，具有*高的單分散性(變異系數(shù):CV=3.47%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示：

參考文獻：

[1] Ching S. H., et al. Alginate gel particles–a review of production techniques and physical properties, Crit. Rev. Food Sci., 57, 1133-1152 (2015).

[2] Wang H , et al. The use of micro- and nanospheres as functional components for bone tissue regeneration , Tissue Eng. Part B Rev., 18, 24-39 (2012).

[3] Wan. J, Microfluidic-Based Synthesis of hydrogel particles for cell microencapsulation and cell-based drug delivery, Polymers, 4, 1084-1108 (2012).

[4] Rowley J.A., et al. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials., Biomaterials, 20 , 45-53 (1999).

[5] Bhatia, S. N., et al. Effect of cell–cell interactions in preservation of cellular phenotype: cocultivation of hepatocytes and nonparenchymal cells. FASEB J. 13, 1883–1900 (1999).

[6] Zhang H., et al. Exploring microfluidic routes to microgels of biological polymers, Macromol. Rapid Comm.，28, 527-538 (2007).

[7] Utech S., et al. Microfluidic generation of monodisperse, structurally homogeneous alginate microgels for cell encapsulation and 3D cell culture，Adv. Heal. Mater., 4, 1628-1633 (2015).