新型灌注生物反應(yīng)器促進(jìn)多能干細(xì)胞在3D生物打印組織腔室中擴(kuò)增的應(yīng)用
摘要
隨著3D生物打印和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)的出現(xiàn)，組織工程領(lǐng)域發(fā)展迅速，但由于缺乏功能豐富的厚組織，影響有限。繞過這一限制的方法之一是用含有 hiPSCs 的3D 生物打印組織。通過這種方式，iPSCs可以在實質(zhì)細(xì)胞分化之前增殖并填充厚組織塊。在這里,我們設(shè)計了一個灌注生物反應(yīng)器，用于裝載hipsc的3d生物打印室， 目的是在分化之前在 整個結(jié)構(gòu)中增殖hipsc，以產(chǎn)生厚組織模型。生物反應(yīng)器由數(shù)字光投影制成，經(jīng)過優(yōu)化，可 以在水凝膠室內(nèi)部灌注而不會泄漏，也可以在外部提供流體流動，從而最大限度地提高整 個室壁的營養(yǎng)輸送。經(jīng)過7天的培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)在3ml min-1下間歇灌注(每15分鐘15秒)，相 對于在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的類似腔室，工程組織中的干細(xì)胞集落密度增加了1.9倍。我們還觀 察到，相對于靜態(tài)對照，灌注結(jié)構(gòu)的組織壁內(nèi)的菌落分布更均勻，反映了培養(yǎng)基中營養(yǎng)物 質(zhì)的均勻分布。在流體流動的作用下，hiPSCs保持多能性和增殖性，產(chǎn)生平均約1.0 dyncm-2 的壁剪切應(yīng)力�？偟膩碚f，這些充滿希望的結(jié)果在灌注干細(xì)胞水凝膠后支持多種組織類 型的產(chǎn)生，并改善了厚度，因此增加了功能和實用性。
1. 介紹
三維（3D）生物打印技術(shù)為創(chuàng)建人體疾病模 型提供了巨大的潛力，可以在體外對疾病機(jī)制、 進(jìn)展和治療進(jìn)行器官級研究。生物打印還可以生 成功能性替代組織，用于治療各種疾病。然而， 人體每個器官都有數(shù)十億個細(xì)胞，要獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞來創(chuàng)建具有代表性的體外組織并非易事 。雖然擠壓生物打印的細(xì)胞密度通常高于其他打 印方式，但目前通常只能達(dá)到每毫升生物墨水?dāng)?shù) 千萬個細(xì)胞的規(guī)模[1]。目前正在開發(fā)使用球體 或胚狀體進(jìn)行無支架生物打印的方法[2-4]，從而提高打印組織的細(xì)胞密度。然而，除了自身的一系列局限性（包括球形變異性、可打印性和打印分辨率方面的挑戰(zhàn)）外，這些方法仍然需要細(xì)胞放大和大容量培養(yǎng)基才能達(dá)到生理密度。為了解決工程組織中細(xì)胞密度低的問題，人們引入了原位干細(xì)胞擴(kuò)增和分化的生物打印方法[5-11]。在這種方法中，被打印在生物墨水中的是干細(xì)胞而不是實質(zhì)細(xì)胞。干細(xì)胞在分化成所需細(xì)胞類型之前，可在工程組織中擴(kuò)增。這對涉及增殖或遷移能力有限的細(xì)胞類型（如心肌細(xì)胞）的應(yīng)用尤其有益，也可作為使用源自患者的原始細(xì)胞的替代方法[5, 12, 13]。這種方法的另一個優(yōu)點是，在分化過程中形成的關(guān)鍵細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和 ECM-ECM 連接可以保持不變，不會被破壞。這一點非常重要，因為 ECM 組織對工程心臟組織的功能至關(guān)重要[14]。此外，在原位分化過程中形成并保存在三維生物打印結(jié)構(gòu)中的微環(huán)境可實現(xiàn)人腔肌泵（hChaMP）的組織和心臟功能[5]。使用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）打印的hChaMP 是由一種生物墨水生成的，這種墨水含有專門針對 hiPSC 生長和分化為心肌細(xì)胞而優(yōu)化的 ECM。hiPSCs 在心肌細(xì)胞分化前增殖兩周，從而使結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞密度更符合生理要求。因此，hChaMP 在整個結(jié)構(gòu)中顯示出連續(xù)的肌肉功能，這一點可以通過光學(xué)繪圖和肌肉組織每次收縮時泵送液體的能力來證明。然而，雖然使用干細(xì)胞進(jìn)行生物打印以及隨后的擴(kuò)增和分化是一項很有前景的技術(shù)，但由于營養(yǎng)供應(yīng)不足，hChaMP顯示出有限的組織厚度[5]，這是組織工程領(lǐng)域眾所周知的問題。營養(yǎng)物質(zhì)（尤其是氧氣）的供應(yīng)限制了工程組織的厚度，通常只能達(dá)到 100-200 微米的存活組織[15]。然而，有了流體流動，就可以通過對流擴(kuò)大營養(yǎng)物質(zhì)的獲取，從而開發(fā)出許多用于工程組織的生物反應(yīng)器[16, 17]。由于多能干細(xì)胞對微環(huán)境敏感，而剪切應(yīng)力已被證明可誘導(dǎo)小鼠干細(xì)胞造血[18]，并促進(jìn)干細(xì)胞衍生前體形成內(nèi)皮細(xì)胞[19, 20]，因此在工程組織中對流擴(kuò)增hiPSC可能會誘發(fā)無意分化。相反，許多生物反應(yīng)器研究表明，利用流體力學(xué)擴(kuò)增干細(xì)胞聚集體或微載體，其效力損失有限[21-25]。在此，我們介紹了為hChaMP開發(fā)的灌注生物反應(yīng)器。我們的研究表明，間歇灌注hChaMP可使細(xì)胞密度在培養(yǎng)一周后增加近兩倍。
此外，盡管暴露在剪切應(yīng)力下，hiPSCs仍能保持多能性，而剪切應(yīng)力近似低于其他常見的干細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器。這些結(jié)果表明，擴(kuò)增的iPSCs分化成所需細(xì)胞類型后，有望生成厚組織模型。
2. 材料與方法
2.1. hChaMP制造
通過Autodesk Meshmixer和Blender（圖1(a)），根據(jù)之前報道的結(jié)構(gòu)[5]重新設(shè)計了hChaMPs ，并在Slic3r中生成了g代碼。打印前一天，在含有 75% mTeSR1（STEMCELLTechnologies，cat#85850）、25% 醋酸（20 mM）和1.3% 苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰（LAP，Allevi）的溶液中，將甲基丙烯酰明膠（GelMA；明尼蘇達(dá)大學(xué)生物打印設(shè)備）在60℃下重組至 26.7% w/v。甲基丙烯酸膠原（ColMA；Advanced Biomatrix，cat#5198）在 20 µM乙酸中溶解至2% w/v，溫度為37℃。打印前，混合GelMA和ColMA溶液（3:1 GelMA溶液：ColMA溶液，即 20% w/v GelMA，0.5% w/v ColMA），并用1M 氫氧化鈉中和。這些研究中使用了 hiPSCs（在肌球蛋白重鏈基因[26]下過表達(dá)細(xì)胞周期蛋白 D2，雌性）。hiPSCs 在 基底膜基質(zhì)（Corning，cat#08-774-552）上的 mTeSR1 中保存，并通過 ReLeSR（STEMCELL Technologies，cat#05872）定期傳代。打印時，用細(xì)胞消化液（Millipore Sigma，cat#A6964）將匯合度為 60%-80% 的 hiPSCs單個化。細(xì)胞懸浮液清洗后離心兩次，以除去可能降解基質(zhì)支架的多余細(xì)胞消化液。然后將細(xì)胞以 3000 萬個細(xì)胞 ml-1 的量重懸在 ECM 溶液中，該溶液含有 187 µg ml-1 小鼠層粘連蛋白/腸粘連蛋白（LN；Corning，cat#354259）、187µg ml-1 人纖連蛋白（FN；Corning，cat#356008 或 R&D systems，cat#1918-FN-02M）和10 µM Y-27632 ROCK 抑制劑（Selleckchem，cat#S1049）的 mTeSR1，并在室溫下孵育 15 分鐘。hChaMPs 在INKREDIBLE擠壓式生物打印機(jī)（CELLINK）上打印。為了提高低粘度生物墨水的分辨率，打印是在基于 FRESH v2.0[27]的支撐浴中進(jìn)行的。支撐浴是在生物安全柜中制作的，以保持無菌狀態(tài)；52.5%的無菌Milli-Q水和47.5%的乙醇混合物在輔助容器中制作的水浴中加熱到45℃。以每分鐘400轉(zhuǎn)的速度攪拌混合物，并用鋁箔覆蓋以減少蒸發(fā)。加入氫氧化鈉（1mM）使pH值升至7，然后加入B型明膠（SigmaAldrich，cat#G9382，2% w/v）和阿拉伯樹膠（Sigma Aldrich，cat#9752，1% w/v）。溶液在45℃下混合10分鐘，然后冷卻至35℃，然后緩慢冷卻至25℃(<1℃ min-1)。然后降低溫度至10℃，再攪拌5分鐘。將混合物轉(zhuǎn)移到錐形管中，在100G下離心4分鐘。將上清替換為冷的、無菌的Milli-Q水，管子旋轉(zhuǎn)，在500G下離心5分鐘。然后用冷的、無菌的1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;Fisher Scientific, cat#BP3994)，并保存在4℃，直到打印當(dāng)天。此時，在1200G下離心3分鐘，去除多余的PBS，薄層紫外線照射30分鐘。生物墨水在27°C下用27 G, 1英寸針頭打印。如前所述[5]，為了保持打印結(jié)構(gòu)的一致性(這對灌注設(shè)置很重要)，壓力根據(jù)針頭的墨水滴速而變化。對于給定的打印結(jié)構(gòu)，這里使用的墨水，滴針之間的滴速為3.1秒。在六個面各打印20秒后，墨水與藍(lán)光(405 nm)交聯(lián)。然后將支撐液中的打印物移到培養(yǎng)箱中熔化支撐液，然后用溫暖、無菌的Dulbecco PBS (DPBS;不含Ca2+和Mg2+;Thermo Fisher Scientific，編號14190144)。hChaMPs在5µM Y-27632的mTeSR1中培養(yǎng)過夜，在靜態(tài)條件下允許細(xì)胞附著。
圖1所示。hChaMP和生物反應(yīng)器設(shè)計。(a)hChaMP模型橫切面(正面)為灌注腔內(nèi)。(b)生物3d打印的hChaMP。(c)生物 反應(yīng)器模型，生物反應(yīng)器的側(cè)視圖，包括頂部和底部部分(上)和底部部分的自頂向下視圖(下),底部部分為hChaMP。
該設(shè)計允許灌注hChaMP 內(nèi)部(實箭頭),以及圍繞hChaMP 外部的流體流動(虛線箭頭)。hChaMP 輕輕放置在細(xì)水平桿上 ,允許在hChaMP底部周圍進(jìn)行外部灌注。(d)3d 打印生物反應(yīng)器，由螺母、螺栓和硅膠墊圈組裝而成。(e)生物反應(yīng)器 中的hChaMP。油管將hChaMP連接到生物反應(yīng)器。(f)整個灌注裝置，生物反應(yīng)器連接到泵和介質(zhì)儲存器。
2.2. hChaMP 灌注
在SOLIDWORKS中設(shè)計生物反應(yīng)器，其中hChaMP內(nèi)部灌注端口(Ini和Outi)和hChaMP外部流動端口(Ine和Oute)(圖1(c))。生物反應(yīng)器通過Perfactory IV數(shù)字光投影打印機(jī)(EnvisionTEC)使用E-shell 300 (EnvisionTEC,cat#1500300)進(jìn)行3d打印(圖1(d))。灌注時，使用Masterflex L/S標(biāo)準(zhǔn)數(shù)字驅(qū)動器(cat#07522-30)與Masterflex L/S 14鉑固化硅膠管(1.6 mm ID, cat#96410-14)。培養(yǎng)基儲液器是一個50 ml的錐形管，蓋子上有三個孔，兩個用于流體的進(jìn)出口，一個用于0.22µm注射器過濾器(Whatman, cat#6780-2502)，允許在培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌氧氣交換。培養(yǎng)基儲層最初填充兩倍體積的培養(yǎng)基(mTeSR Plus [STEMCELLTechnologies, cat#100-0276])，并添加100 μml - 1青霉素，100 μ ml - 1鏈霉素[penp -strep;Thermo Fisher Scientific, cat#15140122]用于灌注的第一天)，而不是管道和生物反應(yīng)器中所需的系統(tǒng)。這樣，在隨后的日子里，只需簡單地更換錐形管，就可以更換 50%的培養(yǎng)基（mTeSR Plus，no pen-strep），從而最大限度地減少排空管道時可能發(fā)生的污染和氣泡形成。靜態(tài)對照在具有等量培養(yǎng)基的立式T25燒瓶中培養(yǎng)，每天也更換50%的培養(yǎng)基。
打印1天后開始灌注。生物反應(yīng)器在生物安全柜中紫外線照射下，70%乙醇浸泡30分鐘滅菌。然后用無菌的1X PBS洗滌生物反應(yīng)器三次。為了準(zhǔn)備hChaMP進(jìn)行灌注(圖S1)，將hChaMP移至有溫DPBS的培養(yǎng)皿中。硅膠管(15mm長，2mm內(nèi)徑，3mm外徑;將uxcell (cat#a19011600ux0295)插入hChaMP的兩條血管中。將插入管的hChaMP移至干凈、干燥的培養(yǎng)皿中，在管和hChaMP的界面處移液無菌的20% GelMA(含0.5% w/v LAP，如上所述溶解于mTeSR1和乙酸中)，同時用藍(lán)光交聯(lián)。將hChaMP移動到充滿DPBS的生物反應(yīng)器中，使用無菌細(xì)齒鉗將管的另一端插入生物反應(yīng)器通道中(圖1(e))。20%的GelMA被添加到每根油管的兩端，以形成防止泄漏的密封。Outi的管(Masterflex C-Flex管，3.2 mm ID，編號06422-04)充滿DPBS，并連接到生物反應(yīng)器上，以消除Outi的表面張力，這種張力會產(chǎn)生壓差，阻礙hChaMP的灌注。為了檢查內(nèi)部灌注是否有泄漏，用食用色素染色的DPBS(通過0.22µm過濾器過濾)用注射器和針頭注射到Ini。如果油管連接處存在泄漏，則使用20%以上的GelMA。染色的DPBS用mTeSR Plus溫水沖洗。然后將生物反應(yīng)器連接到灌注裝置上。將生物反應(yīng)器連接到引管上，在生物反應(yīng)器上放置30mm硅膠墊片，并用螺母和螺栓固定生物反應(yīng)器蓋。將泵打開至3ml min - 1，以去除生物反應(yīng)器中剩余的空氣。將灌注設(shè)置(圖1(f))移至培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)，并將流量改為間歇，每15分鐘以3ml min - 1的速度流動15 s。每天進(jìn)行50%的介質(zhì)更換，直到灌注結(jié)束。
2.3. 計算模擬
為了建立 hChaMP 中流體流動的計算模型，在生物反應(yīng)器的入口和出口處測量了流動下的壓力。簡言之，如上所述，將無細(xì)胞 hChaMP 插入生物反應(yīng)器并連接流動。在生物反應(yīng)器入口或出口的底部放置止血閥（Qosina，cat#80395），以便在設(shè)置中插入壓力導(dǎo)管。使用 ADV500 PV系統(tǒng)和 1.4 Fr 壓力導(dǎo)管（Transonic）測量壓力曲線，數(shù)據(jù)采集采樣率為 5000 Hz。在Simvascular中使用流固相互作用(FSI)方法來解析內(nèi)部流動[28]。根據(jù)實驗結(jié)果，采用彈性模量為1.96 kPa的新hookean模型來描述墻。流體模型采用牛頓流體模型，粘度為1 cP，用波形描述進(jìn)口的間歇流動，并在出口施加與實驗結(jié)果相匹配的壓力作為邊界條件。為了穩(wěn)定系統(tǒng)中的壓力，在明尼蘇達(dá)超級計算研究所進(jìn)行了十個周期的模擬。外部流動使用Ansys Fluent, release 20.1進(jìn)行求解，假設(shè)墻壁是剛性的。與內(nèi)部流動模擬一樣，將流體描述為粘度為1 cP的牛頓流體，并施加一個波形作為進(jìn)口邊界條件，其流量與內(nèi)部流動模擬的出口結(jié)果相匹配。出口設(shè)為零參考壓力。
2.4.冷凍切片和免疫熒光(IF)染色
培養(yǎng)7天后，去除hChaMP底部(頂端)進(jìn)行核糖核酸(RNA)提取(見下文)。剩余的hChaMP在4℃下用4%多聚甲醛固定過夜。第二天，hChaMPs用1X PBS洗滌三次。hChaMP腔室(在血管和切除的頂點之間)被切成兩部分，以便從結(jié)構(gòu)的不同區(qū)域進(jìn)行切片。切片前，樣品在30% w/v蔗糖的PBS中4?C孵育2 d。為了準(zhǔn)備冷凍樣品，將樣品移動到30%蔗糖:O.C.T.的1:1混合物中化合物(Tissue-Tek，編號25608-930)孵育1.5小時，然后在O.C.T.化合物中低溫模孵育3小時。然后將樣品在-80℃下冷凍。使用徠卡CM1900低溫恒溫器對樣品進(jìn)行10µm厚度的切片。將載玻片置于室溫下過夜，第二天使用或移至- 20℃。為了通過hChaMP成像細(xì)胞分布，切片用5µg ml?1 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, Invitrogen, cat#D1306)染色8分鐘，然后用DAPI/1,4-重氮雜環(huán)[2,2,2]辛烷(DABCO;Sigma-Aldrich, cat#D27802)在甘油和PBS。在徠卡DMi8熒光顯微鏡下，將載玻片成像為瓦片。為了量化ImageJ中的菌落密度，使用瓦片掃描明場圖像跟蹤切片的邊緣，將dapi標(biāo)記的瓦片掃描進(jìn)行二值化，并使用Analyze Particles功能識別大于或等于1000µm2的細(xì)胞菌落。每個hChaMP分析了5個切片。通過在明場切片(菌落不容易可視化的地方)上沿著每個切片的厚度(從室外到室內(nèi))繪制10條線來定量分布，然后沿著每條線找到二值化DAPI的Plot Profile。在Microsoft Excel中分析剖面，以確定在組織厚度的每五分之一段內(nèi)發(fā)生的情況。平均壁厚計算為所有線的平均長度。對于IF，用0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, cat#T8787)滲透1小時，用5%牛血清白蛋白、1%甘氨酸、2%山羊血清和0.1% Triton X-100 (BGST)的溶液阻斷2小時。在BGST中，一級抗體(1µg ml-1小鼠anti-OCT3/4 [Santa CruzBiotechnology, cat#sc-5279]， 5µg ml-1小鼠anti-KI67 [BD Biosciences, cat#556003]，和2.5µg ml-1兔 anti-PAX6 [Invitrogen, cat#42-6600]，圖S2)在4℃下在切片上孵育過夜。在次級抗體(4µg ml-1 AlexaFluor 647羊 anti-mouse[Invitrogen, cat#A21236]或AlexaFluor 647羊anti-rabbit [Invitrogen, cat#A32733])中孵育2小時前，用0.2% Tween-20 (Millipore, cat#655204)在1XPBS中洗滌2次，用1XPBS洗滌1次。樣品再次用Tween-20和PBS洗滌，然后用DAPI染色，并如上所述用DAPI/DABCO涂載。采集菌落20×圖像，在ImageJ中定量熒光標(biāo)記面積。具體來說，DAPI圖像是二值化的，并且使用AnalyzeParticles特征來跟蹤集落邊界，作為集落小于1000µm2的感興趣區(qū)域(roi)。然后對相應(yīng)的IF圖像進(jìn)行二值化處理，將每個ROI內(nèi)標(biāo)記物覆蓋的面積量化歸一化為相應(yīng)ROI內(nèi)的DAPI密度。對于每個標(biāo)記，每個hChaMP分析了>30個菌落。
2.5. RT-qPCR
用刀片輕輕去除hChaMPs的頂端，并在液氮罐中快速冷凍，以備將來提取RNA。樣品裂解并使用PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen，編號12183018A)分離RNA。使用Gen5軟件在Cytation3成像閱讀器(BioTek)上定量RNA的質(zhì)量和數(shù)量。cDNA使用SuperScript IV VILO MasterMix (Invitrogen, cat#11756050)根據(jù)制造商的說明創(chuàng)建。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)使用PowerSYBR Green Master Mix (1X,Applied Biosystems, cat#4367659)在RocheLightCycler 96(多能性標(biāo)記，60°C退火)或Eppendorf Mastercycler ep realplex2(胚層標(biāo)記，55°C退火)上進(jìn)行30個循環(huán)。標(biāo)記物的表達(dá)被標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。引物序列來源于文獻(xiàn)(Integrated DNA Technologies，表S1)，并根據(jù)primer-blast[29]中所關(guān)注基因的特異性和低二聚化可能性，根據(jù)Integrated DNATechnologies 的 OligoAnalyzer Tool 選擇引物對。陽性對照的hipsc衍生的胚層組織如補(bǔ)充信息中所述。
2.6. 統(tǒng)計
每種情況下測試三個hChaMPs。在JMP Pro16.0中進(jìn)行樣本組比較。對不相等均值(雙尾)的零假設(shè)計算p值，置信區(qū)間為95%。采用學(xué)生t檢驗計算靜態(tài)和灌注hChaMPs的p值，而RT-qPCR的多個條件采用方差分析(ANOVA)檢驗和事后Tukey-Kramer誠實顯著性差異(HSD)檢驗進(jìn)行比較。
3. 結(jié)果
3.1. 生物反應(yīng)器的設(shè)計與灌注參數(shù)的選擇為灌注設(shè)計的hChaMP結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示(視頻S1)。該結(jié)構(gòu)在先前報道的結(jié)構(gòu)[5]基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，作為單個心室，允許未來通過施加流體流動和機(jī)械閥驅(qū)動來建模心室功能(即泵送)。hChaMP是通過擠壓打印的生物打印(圖1(b))，由含有hiPSCs(1500萬ml - 1細(xì)胞)、明膠甲基丙烯酰(GelMA)、甲基丙烯化膠原蛋白、層粘連蛋白/腸動蛋白和纖維連接蛋白的生物墨水形成。由于ecm支架的微妙性質(zhì)，其存儲模量為1.79±0.13 kPa(圖S3)，因此設(shè)計了一個生物反應(yīng)器來支持hChaMP在整個灌注過程中(圖1(c) - (e))。短管被用作hChaMP和生物反應(yīng)器之間的連接。將管插入hChaMP中，在連接處加入無菌的20%GelMA并光交聯(lián)以將管密封到位。該生物反應(yīng)器包含一個隔間，用于穩(wěn)定定位hChaMP，并具有兩個通道，用于插入連接到hChaMP的管道。生物反應(yīng)器被設(shè)計成適當(dāng)?shù)匾龑?dǎo)流體通過hChaMP的內(nèi)部，然后繞過外部(圖1(c)和視頻S2-S3)，以最大限度地實現(xiàn)營養(yǎng)交換。為了減少通過hChaMP的流體阻力，Outi比Ini大。從Outi流出的水流流入Ine, Ine進(jìn)入hChaMP下方的生物反應(yīng)器隔間，并從hChaMP上方的蓋子流出Oute(圖1(c)和視頻S3)。在完成提供內(nèi)部和外部流動的生物反應(yīng)器設(shè)計后，考慮灌注流速。每30-60分鐘灌注1分鐘，這種不頻繁的灌注方式導(dǎo)致細(xì)胞生長很少，可能是由于生物反應(yīng)器和hChaMP內(nèi)缺乏氧氣交換以及廢物去除有限。因此，采用每15分鐘15 s的間歇灌注。這種流動的持續(xù)時間允許在hChaMP內(nèi)部完全改變介質(zhì)，并且頻率支持組織內(nèi)的細(xì)胞存活。
值得注意的是，在生物反應(yīng)器中對hChaMP施加壓力增加的情況下，泄漏將持續(xù)發(fā)生在管道-hChaMP界面。這種壓力限制限制了該模型在下游應(yīng)用中的實用性，因為當(dāng)接口處存在泄漏時，hChaMP無法達(dá)到更高的壓力。因此，我們探索了提高軟組織對疏水管粘附性的方法。經(jīng)3-(三甲氧基硅基)甲基丙烯酸丙酯預(yù)處理(補(bǔ)充方法，圖S5(a))，油管與添加在油管- hchamp界面的GelMA的結(jié)合得到改善。這使得界面可以承受更高的壓力，hChaMP本身在破裂前的最大壓力達(dá)到16.8±0.6 mmHg(圖S5(b)， (c)和視頻S4)。這是系統(tǒng)使用蠕動泵(~ 8.2 mmHg)時的平均壓力的兩倍。然而，這個最大壓力或“爆裂”壓力被發(fā)現(xiàn)低于蠕動泵施加的最大壓力(~ 27.1 mmHg)。這種差異可歸因于蠕動泵的振蕩壓力，其中低壓和高壓的快速波動導(dǎo)致hChaMP的膨脹和收縮(視頻S3)。在爆炸試驗中，壓力被緩慢地直接施加到hChaMP壁上，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不斷膨脹(圖S5(b)和視頻S4)，直到壁上變得太弱而無法容納更多的流體。
3.2. 流體流動參數(shù)的近似值
為了近似計算流體流動對hChaMP的影響，特別是在hChaMP壁面處的壓力和剪切應(yīng)力，進(jìn)行了計算模擬。將壓力導(dǎo)管插入Ini或Outi底部的止血閥，測量hChaMP入口和出口的壓力分布。在計算模型中，將測量到的壓力剖面的最大值、最小值和平均值作為hChaMP流動的輸入。SimVascular svFSI求解器是一款專門用于心血管模擬的開源軟件[28]，用于求解hChaMP的內(nèi)部流動曲線。該軟件之前已經(jīng)在體外模型中進(jìn)行了驗證，并證明了其在描述流動動力學(xué)方面的有效性[30]。使用該軟件和hChaMP的3D模型，流體流動曲線與體外實驗的結(jié)果相匹配(圖2(b)、S4和視頻S2)，證實了該模型復(fù)制系統(tǒng)的能力。這允許計算在hChaMP內(nèi)壁上產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，這是干細(xì)胞培養(yǎng)的一個關(guān)鍵參數(shù)。
發(fā)現(xiàn)hChaMP內(nèi)的壓力相當(dāng)均勻，在單個泵循環(huán)中的變化與實驗值相匹配，平均約為4.5-5.3mmHg，最大值為25.5 mmHg(圖2(c))。壓力在其最小值為負(fù)，反映了在泵的脈動循環(huán)中所看到的情況。在灌注數(shù)天后，這種壓力的變化似乎沒有引起hChaMP完整性的問題。壁面剪切應(yīng)力變化較小，平均值約為1.0 dyn cm-2，在大部分hChaMP腔室中最大值為2.7 dyn cm-2，盡管在Outi附近隨著流體流出腔室急劇增加，達(dá)到15.0 dyn cm-2(圖2(c))。
由于外流存在復(fù)雜的幾何形狀，采用AnsysFluent求解外流廓線。Fluent是開源軟件SimVascular的商業(yè)替代品，已被廣泛用于心血管系統(tǒng)的流體流動模式演示，包括體外模型[31]。求解了外流動廓形，實現(xiàn)了hChaMP外壁面剪應(yīng)力的計算。外部的壓力和壁面剪切應(yīng)力要低得多，這可能是由于生物反應(yīng)器的大隔間尺寸和從Outi到Ine的壓力下降，導(dǎo)致hChaMP周圍的流量較低(圖2(d) - (f))。
有趣的是，外部的壓力取決于所分析的位置。流體首先與hChaMP接觸的下側(cè)最大壓力高于上側(cè);然而，兩者的差別相當(dāng)小，底部的最大壓力為1.13 × 10-4 mmHg，上部的最大壓力為1.05× 10-4 mmHg。與內(nèi)部流動的壓力相似，hChaMP外部的最小壓力略為負(fù)，但在10 - 6 mmHg的量級上。墻體剪應(yīng)力也遠(yuǎn)低于內(nèi)部，范圍在10-7 -10-5 dyn cm?2之間(圖2(f))。總體而言，內(nèi)壁剪切應(yīng)力與干細(xì)胞擴(kuò)增的普通生物反應(yīng)器的剪切應(yīng)力范圍相似，而外部剪切應(yīng)力遠(yuǎn)低于其值，據(jù)報道約為0.7 - 2.5 dyn cm-2[32-34]。此外，發(fā)現(xiàn)水凝膠中嵌入的干細(xì)胞能夠承受大于30 dyn cm-2的應(yīng)力[22]，這表明我們設(shè)置的剪切應(yīng)力近似于hiPSC擴(kuò)增是合理的。
3.3. 灌注對hiPSCs生長和分布的影響為了確定流體流動對hiPSC增殖和分布的影響，在打印后1 d將hChaMPs插入生物反應(yīng)器中進(jìn)行灌注，使細(xì)胞有時間附著在結(jié)構(gòu)上(圖3(a))。隨后的每一天，錐形管作為介質(zhì)儲存庫替換為新鮮介質(zhì)。油管中的介質(zhì)，大約相當(dāng)于系統(tǒng)中總體積的一半，沒有被排干，以防止污染或氣泡進(jìn)入系統(tǒng)。因此，每天使用mTeSR Plus更換50%的培養(yǎng)基。隨著組織工程中的生物制造技術(shù)變得越來越復(fù)雜，污染風(fēng)險也隨之增加。然而，干細(xì)胞一般避免使用抗生素，即使是短期治療也是如此[35]。在這里，青霉素鏈霉素在灌注的第一天加入，并在隨后的培養(yǎng)基更換中逐漸稀釋。在這種情況下，短期暴露于青霉素-鏈霉素對三維培養(yǎng)中單一化hiPSCs的增殖和效力沒有影響（圖S6）。
圖3所示。灌注可改善hiPSC菌落的覆蓋和分布。(a) hChaMP增殖時間線，打印后第1天開始間歇灌注。(b) hChaMP橫 截面，用DAPI染色(白色)顯示培養(yǎng)7 d后，灌注或不灌注時整個hChaMP的細(xì)胞密度。(c)與靜態(tài)對照相比，灌注樣品中 hChaMP中的菌落密度增加了一倍。(d)間歇灌注不影響壁厚。(e)在hChaMP細(xì)胞壁上劃線，在ImageJ中進(jìn)行處理，確定 菌落在細(xì)胞壁上的分布。灌注后的hChaMPs與靜態(tài)hChaMPs相比，壁中部的菌落明顯增加。在組織壁各區(qū)域進(jìn)行靜態(tài)和灌注hChaMPs的比較。n = 3 hChaMPs。統(tǒng)計上不顯著;#p < 0.1，*p < 0.05，**p < 0.01)。
此外，與靜態(tài)培養(yǎng)的hChaMPs相比，灌注hChaMPs改善了hiPSC菌落在細(xì)胞壁內(nèi)的分布(圖3(e))。灌注的hChaMPs中，大多數(shù)hipsc位于組織壁的中部，在組織壁的不同區(qū)域間菌落數(shù)量變化較小。另一方面，靜態(tài)對照的菌落位于hChaMP外側(cè)附近，在整個組織中的分布較少。有趣的是，灌注和靜態(tài)hChaMP在hChaMP最外層的菌落百分比相對于下一個內(nèi)部部分都要低。這可能是由于在支撐槽移除和介質(zhì)改變或灌注過程中細(xì)胞丟失所致。3.4. 灌注對hiPSC多能性的影響為了測試來自流體流動的剪切應(yīng)力是否會導(dǎo)致hiPSCs的不良分化，對hChaMPs的冷凍切片進(jìn)行OCT3/4 IF染色(圖4(a))。集落的定性和定量分析表明，幾乎所有細(xì)胞都保持多能性，多能性與靜態(tài)對照相當(dāng)。此外，細(xì)胞高度增殖，KI67在整個菌落中呈陽性表達(dá)(圖4(b))。這表明hipsc在間歇灌注后仍保持其多能性和自我更新特性。接下來，使用RT-qPCR來量化多能性標(biāo)記，以及來自每個胚層的標(biāo)記，以在轉(zhuǎn)錄物水平上確認(rèn)我們的結(jié)果(圖4(c))。與2D培養(yǎng)的hiPSC對照相比，在靜態(tài)和灌注狀態(tài)下，OCT4、NANOG和SOX2的表達(dá)均保持較高水平�？偟膩碚f，除了一個例外，沒有檢測到胚層標(biāo)記物，或者發(fā)現(xiàn)相對
于hiPSCs或靜態(tài)hChaMPs的水平不顯著。外胚層標(biāo)志物PAX6在灌注hChaMP細(xì)胞中的表達(dá)高于2DhiPSCs (p=0.044)。然而，IF染色顯示PAX6在hChaMPs中沒有蛋白水平的表達(dá)(圖4(d))。
4. 結(jié)論在這里，我們展示了灌注hiPSCladen生物打印組織的能力，目的是增加工程組織的活細(xì)胞厚度。僅培養(yǎng)7天后，灌注就能顯著提高菌落密度，這是我們通常hChaMP增殖周期的一半。先前的灌注生物反應(yīng)器研究[36-40]發(fā)現(xiàn)，使用原代細(xì)胞類型可以提高組織內(nèi)的生存能力，而我們能夠使用對環(huán)境高度敏感的多能干細(xì)胞復(fù)制結(jié)果。此外，這些先前的研究通常是直接通過支架的孔隙向組織間質(zhì)灌注。在這里，我們展示了在組織周圍而不是直接通過組織的大體積流體流動中獲得類似結(jié)果的能力。因此，本文所描述的與最佳生物反應(yīng)器設(shè)計、通過精致水凝膠腔灌注以及hipsc的流動考慮相關(guān)的概念將為潛在的任何組織類型的研究鋪平道路。在這種結(jié)構(gòu)分化后，可以產(chǎn)生較厚的組織，并伴隨組織功能的增加。
生物反應(yīng)器的開發(fā)是一個反復(fù)的過程，成功增殖的最重要參數(shù)是對軟水凝膠的精細(xì)處理和連接處的防泄漏，以確保通過hChaMP內(nèi)部進(jìn)行灌注。早期嘗試以垂直、直立的姿勢灌注hChaMP，成功地提高了細(xì)胞在內(nèi)部的活力。然而，難以設(shè)置hChaMP進(jìn)行灌注，并且需要一個小的隔間尺寸來保持hChaMP，最大限度地減少了hChaMP周圍的營養(yǎng)物質(zhì)體積，使得這些生物反應(yīng)器設(shè)計不切實際。因此，目前的生物反應(yīng)器設(shè)計將hChaMP放置在仰臥位置，為養(yǎng)分交換提供了簡單的設(shè)置和足夠的培養(yǎng)基體積。精細(xì)的操作仍然是灌注成功的關(guān)鍵。在hChaMP打印分辨率較差的情況下，管子插入變得更加困難，需要更嚴(yán)格的處理，導(dǎo)致培養(yǎng)第7天菌落形成急劇減少。此外，壓差在確保通過hChaMP內(nèi)部灌注方面發(fā)揮了重要作用。設(shè)計初期的一個常見問題是hChaMP油管連接處的泄漏，盡管添加了GelMA來形成密封。我們發(fā)現(xiàn)，在灌注前，必須在Outi處連接充滿DPBS的油管，以消除表面張力，這種張力會產(chǎn)生壓差，阻礙hChaMP內(nèi)部的灌注，導(dǎo)致連接處泄漏。再加上Outi相對于進(jìn)油管尺寸的增加，從本質(zhì)上解決了這個問題，促進(jìn)了流體通過hChaMP內(nèi)部的流動。翻譯生物打印方法的一個很大的限制是需要大量的細(xì)胞達(dá)到生理密度，當(dāng)工程組織的大小增加到生理尺度時，這一點尤為重要。允許細(xì)胞在原位增殖減少了對大量孔板和相應(yīng)的單層擴(kuò)增介質(zhì)體積的需求。在這里，只需要一個6孔板(1000萬個hiPSCs)就可以產(chǎn)生厘米級的hChaMP。進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)時間、打印時的細(xì)胞密度，或調(diào)整ROCK抑制劑和/或類似的生化化合物處理，可以進(jìn)一步增加分化前的hiPSC密度。增加培養(yǎng)時間可能會允許進(jìn)一步的細(xì)胞生長，但不適合擴(kuò)大規(guī)模和組織應(yīng)用。這也可能進(jìn)一步影響基因表達(dá)。在培養(yǎng)的第7天，多能性和胚層標(biāo)記物在RNA水平上幾乎沒有變化，但灌注的hChaMPs中外胚層標(biāo)記物PAX6略有增加。在蛋白水平上，PAX6未在hChaMPs中表達(dá)。這一結(jié)果與暴露于0.003 - 5 dyn cm - 2剪切應(yīng)力下的小鼠PSCs的研究一致，其中神經(jīng)標(biāo)記物的表達(dá)與靜態(tài)培養(yǎng)相當(dāng)[41,42]。與2D培養(yǎng)的hiPSCs相比，灌注的hChaMPs中NANOG RNA表達(dá)也有輕微但不顯著的增加。有趣的是，最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，在暴露于流動的小鼠iPSCs中，NANOG和OCT4的表達(dá)也有類似的增加，這可能是由于涉及E-cadherin和/或β-catenin的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)[43]。此外，在人類多能干細(xì)胞中，NANOG被認(rèn)為可以抑制外胚層的形成[44]，并通過調(diào)節(jié)進(jìn)入細(xì)胞周期的s期來增加細(xì)胞增殖[45]，這表明NANOG可能在灌注的hChaMPs中發(fā)揮有益作用。因此，需要進(jìn)一步的研究來確定長時間灌注對hiPSCs的影響。生物墨水中的細(xì)胞密度可能會進(jìn)一步優(yōu)化以增加菌落數(shù)量，但正如所討論的那樣，這受到用于打印的噴嘴尺寸的限制。另外，用10µM ROCK抑制劑Y-27632或法舒地爾治療多日可提高干細(xì)胞增殖率，s期細(xì)胞比例增加[46]。同樣，類黃酮3,2 ' -二羥黃酮(3,2 ' DHF)已被證明可以增加hiPSCs的增殖、s期細(xì)胞的百分比和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的表達(dá)[47]，這可能在細(xì)胞增殖的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用[48]。與單獨使用任何一種分子相比，3,2 ' -DHF和Y-27632聯(lián)合處理hiPSCs進(jìn)一步改善了增殖[47]，這表明有希望的方法可以與灌注結(jié)合進(jìn)一步改善細(xì)胞密度和組織厚度。在hChaMP中獲得所需的hiPSC密度后，下一步將是分化。先前的研究表明，在剪切作用下，有可能分化為中胚層[49-52]、內(nèi)胚層[53,54]和外胚層[51,55]。此外，考慮到剪切應(yīng)力在胎兒發(fā)育中的作用[56-59]，仿生血流可能有利于分化組織的功能。然而，在某些分化情況下，高水平的剪切應(yīng)力是有害的。例如，Ting等人發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞分化過程中，在搖椅上持續(xù)攪拌導(dǎo)致心肌細(xì)胞非常少;然而，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，間歇性攪拌可使分化效率提高約38%[49]。同樣，在微載體的肝臟分化中，在分化的早期階段，超過30 rpm的攪拌會導(dǎo)致細(xì)胞脫離微載體[54]。因此，生物反應(yīng)器中的分化參數(shù)需要針對所需的組織類型進(jìn)行優(yōu)化，以平衡營養(yǎng)輸送/廢物清除和維持細(xì)胞健康。作為誘導(dǎo)多系分化進(jìn)展的方法，原位hiPSC增殖的效用可以進(jìn)一步增強(qiáng)[60-65]。這種方法，從不同的支架材料特性到改變細(xì)胞因子或培養(yǎng)基成分以及基因工程hiPSCs，可以很容易地轉(zhuǎn)化為生物打印和生物反應(yīng)器設(shè)置，以獲得大量不同類型的細(xì)胞。分化為多種組織類型，可以研究發(fā)育過程中相關(guān)組織的形成，疾病進(jìn)展中不同組織之間的串?dāng)_，或各種治療方法和劑量對各種器官的潛在影響。例如，起搏器和心室心肌細(xì)胞的空間分化將極大地增強(qiáng)藥物篩選研究，提供對給定治療的心律和泵功能的見解。纖維母細(xì)胞、免疫細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的摻入也可以進(jìn)一步增強(qiáng)仿生功能。
同樣，許多組織工程研究現(xiàn)在都集中在結(jié)合血管的方法上，以增加營養(yǎng)供應(yīng)和可能的組織厚度。然而，在我們的實驗中納入內(nèi)皮細(xì)胞和其他相關(guān)細(xì)胞類型可能會導(dǎo)致不必要的旁分泌信號，從而影響打印組織中干細(xì)胞的多能性或分化效率[66]。在分化為所需的細(xì)胞類型后，內(nèi)皮細(xì)胞可以被納入像我們這樣的模型中，其中灌注可以進(jìn)一步實現(xiàn)對內(nèi)皮重要的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)[67,68]，并可能誘導(dǎo)血管生成[69]。血管的存在將允許營養(yǎng)輸送的增加，從而進(jìn)一步開發(fā)工程組織的效用。
生物3D打印領(lǐng)域的最新發(fā)展極大地擴(kuò)展了創(chuàng)造復(fù)雜的、與生理相關(guān)的體外組織的潛力。當(dāng)這些組織由人類來源的細(xì)胞形成時，所產(chǎn)生的模型可以提供對疾病機(jī)制、進(jìn)展和治療的增強(qiáng)研究，作為動物模型的補(bǔ)充。在這里，我們利用介質(zhì)灌注和3d生物打印室結(jié)構(gòu)中hipsc的高增殖能力，實現(xiàn)了生成厚組織模型的目標(biāo)�？偟膩碚f，我們預(yù)計，隨著該領(lǐng)域在創(chuàng)造更復(fù)雜組織方面的發(fā)展，特別是與正在開發(fā)的工程策略相結(jié)合，這種在這種模型中擴(kuò)展hipsc的能力將是重要的。在該模型中看到的連續(xù)的hipsc集落的形成將允許各種組織類型的原位分化，以便生成具有更高功能和一致性的組織，從而可靠地進(jìn)行體外建模。
數(shù)據(jù)可用性聲明支持本研究結(jié)果的所有數(shù)據(jù)都包含在文章中(以及任何補(bǔ)充文件)。
致謝我們感謝Jeffrey Ai幫助重新設(shè)計用于灌注的hChaMP結(jié)構(gòu)，Aimee Renaud生成外胚層陽性對照，Victor Garcia獲得hChaMP、生物反應(yīng)器和裝置的圖像，以及明尼蘇達(dá)大學(xué)實驗外科服務(wù)部門幫助測量破裂壓力。我們感謝我們的資金來源，美國國立衛(wèi)生研究院T32GM008347 (ERK)，R01HL137204 (ERK, WL和BMO)和NIBIB/NIH工程復(fù)雜組織中心P41 EB023833，以及美國心臟協(xié)會905669 (ERK)。
參考文獻(xiàn)
[1]Gudapati H, Dey M and Ozbolat I 2016 A comprehensivereview on droplet-based bioprinting: past, present andfuture Biomaterials 102 20–42
[2] Skylar-Scott M A, Uzel S G M, Nam L L, Ahrens J H,Truby R L, Damaraju S and Lewis J A 2019Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellulardensity and embedded vascular channels Sci. Adv. 5 9
[3]Murata D, Arai K and Nakayama K 2020 Scaffold-freebio-3D printing using spheroids as ‘bio-inks’ for tissue(re-)construction and drug response tests Adv. HealthcareMater. 9 1901831
[4] Daly A C, Davidson M D and Burdick J A 2021 3Dbioprinting of high cell-density heterogeneous tissue modelsthrough spheroid fusion within self-healing Nat. Commun.12 1–13
[5] Kupfer M E et al 2020 In situ expansion, differentiation andelectromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3Dbioprinted, chambered organoid Circ. Res. 127 207–24
[6] Ouyang L, Yao R, Mao S, Chen X, Na J and Sun W 2015Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cellsdirects highly uniform embryoid body formationBiofabrication 7 4
[7] Faulkner-Jones A, Fyfe C, Cornelissen D-J, Gardner J, King J,Courtney A and Shu W 2015 Bioprinting of humanpluripotent stem cells and their directed differentiation intohepatocyte-like cells for the generation of mini-livers in 3DBiofabrication 7 4
[8] Ouyang L, Yao R, Zhao Y and Sun W 2016 Effect of bioinkproperties on printability and cell viability for 3Dbioplotting of embryonic stem cells Biofabrication 8 3
[9] Gu Q, Tomaskovic-Crook E, Wallace G G and Crook J M2017 3D bioprinting human induced pluripotent stem cellconstructs for in situ cell proliferation and successivemultilineage differentiation Adv. Healthcare Mater. 6 17
[10] Li Y, Jiang X, Li L, Chen Z-N, Gao G, Yao R and Sun W 20183D printing human induced pluripotent stem cells withnovel hydroxypropyl chitin bioink: scalable expansion anduniform aggregation Biofabrication 10 4
[11] Hamid O A, Eltaher H M, Sottile V and Yang J 2021 3Dbioprinting of a stem cell-laden, multi-material tubularcomposite: an approach for spinal cord repair Mater. Sci.Eng. C 120 111707
[12] Kerscher P, Turnbull I C, Hodge A J, Kim J, Seliktar D,Easley C J, Costa K D and Lipke E A 2016 Direct hydrogelencapsulation of pluripotent stem cells enables ontomimeticdifferentiation and growth of engineered human hearttissues Biomaterials 83 383–95
[13] Gilmozzi V et al 2021 Generation of hiPSC-derivedfunctional dopaminergic neurons in alginate-based 3Dculture Front. Cell Dev. Biol. 9 708389
[14] Gao L et al 2017 Myocardial tissue engineering with cellsderived from human-induced pluripotent stem cells and anative-like, high-resolution, 3-dimensionally printedscaffold Circ. Res. 120 1318–25
[15] Radisic M, Malda J, Epping E, Geng W, Langer R andVunjak-Novakovic G 2006 Oxygen gradients correlate withcell density and cell viability in engineered cardiac tissueBiotechnol. Bioeng. 93 332–43
[16] Ahmed S, Chauhan V M, Ghaemmaghami A M andAylott J W 2018 New generation of bioreactors that advanceextracellular matrix modelling and tissue engineeringBiotechnol. Lett. 41 1–25
[17] Zhang J, Wehrle E, Rubert M and Müller R 2021 3Dbioprinting of human tissues: biofabrication, bioinks, andbioreactors Int. J. Mol. Sci. 22 3971
[18] Adamo L et al 2009 Biomechanical forces promoteembryonic haematopoiesis Nature 459 1131–5
[19] Yamamoto K, Sokabe T, Watabe T, Miyazono K,Yamashita J K, Obi S, Ohura N, Matsushita A, Kamiya A andAndo J 2005 Fluid shear stress induces differentiation ofFlk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelialcells in vitro Am. J. Physiol. Circ. Physiol. 288 H1915–24
[20] Ahsan T and Nerem R M 2010 Fluid shear stress promotesan endothelial-like phenotype during the earlydifferentiation of embryonic stem cells Tissue Eng. A 16 3547
[21] Greuel S, Freyer N, Hanci G, Böhme M, Miki T, Werner J,Schubert F, Sittinger M, Zeilinger K and Mandenius C-F2019 Online measurement of oxygen enables continuousnoninvasive evaluation of human-induced pluripotent stemcell (hiPSC) culture in a perfused 3D hollow-fiber bioreactorJ. Tissue Eng. Regen. Med. 13 1203–16
[22] Fattahi P et al 2021 Core–shell hydrogel microcapsulesenable formation of human pluripotent stem cell spheroidsand their cultivation in a stirred bioreactor Sci. Rep.11 1–13
[23] Isidro I A et al 2021 Online monitoring of hiPSC expansionand hepatic differentiation in 3D culture by dielectricspectroscopy Biotechnol. Bioeng. 118 3610–7
[24] Borys B S et al 2021 Overcoming bioprocess bottlenecks inthe large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates invertical-wheel stirred suspension bioreactors Stem Cell Res.Ther. 12 1–19
[25] Nogueira D E S, Rodrigues C A V, Carvalho M S,Miranda C C, Hashimura Y, Jung S, Lee B and Cabral J M S2019 Strategies for the expansion of human inducedpluripotent stem cells as aggregates in single-useVertical-WheelTM bioreactors J. Biol. Eng. 13 74
[26] Zhu W, Zhao M, Mattapally S, Chen S and Zhang J 2018CCND2 overexpression enhances the regenerative potency ofhuman induced pluripotent stem cell-derivedcardiomyocytes: remuscularization of injured ventricle Circ.Res. 122 88–96
[27] Lee A, Hudson A R, Shiwarski D J, Tashman J W, Hinton T J,Yerneni S, Bliley J M, Campbell P G and Feinberg A W 20193D bioprinting of collagen to rebuild components of thehuman heart Science 365 482–7
[28] Figueroa C A, Vignon-Clementel I E, Jansen K E,Hughes T J R and Taylor C A 2006 A coupled momentummethod for modeling blood flow in three-dimensionaldeformable arteries Comput. Methods Appl. Mech. Eng.195 5685–706
[29] Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S andMadden T L 2012 Primer-BLAST: a tool to designtarget-specific primers for polymerase chain reaction BMCBioinform. 13 134
[30] Kung E O, Les A S, Figueroa C A, Medina F, Arcaute K,Wicker R B, McConnell M V and Taylor C A 2011 In vitrovalidation of finite element analysis of blood flow indeformable models Ann. Biomed. Eng. 39 1947–60
[31] Bonfanti M, Franzetti G, Homer-Vanniasinkam S,Díaz-Zuccarini V and Balabani S 2020 A combined in vivo, invitro, in silico approach for patient-specific haemodynamicstudies of aortic dissection Ann. Biomed. Eng. 48 2950–64
[32] Sargent C Y, Berguig G Y, Kinney M A, Hiatt L A,Carpenedo R L, Berson R E and McDevitt T C 2010Hydrodynamic modulation of embryonic stem celldifferentiation by rotary orbital suspension cultureBiotechnol. Bioeng. 105 611–26
[33] Wang Y, Chou B K, Dowey S, He C, Gerecht S and Cheng L2013 Scalable expansion of human induced pluripotentstem cells in the defined xeno-free E8 medium underadherent and suspension culture conditions Stem Cell Res.11 1103–16
[34] Ismadi M Z, Gupta P, Fouras A, Verma P, Jadhav S, Bellare Jand Hourigan K 2014 Flow characterization of a spinnerflask for induced pluripotent stem cell culture applicationPLoS One 9 e106493
[35] Farzaneh M 2021 Concise review; effects of antibiotics andantimycotics on the biological properties of humanpluripotent and multipotent stem cells Curr. Stem Cell Res.Ther. 16 400–5
[36] Carrier R L, Rupnick M, Langer R, Schoen F J, Freed L E andVunjak-Novakovic G 2002 Perfusion improves tissuearchitecture of engineered cardiac muscle Tissue Eng.8 175–88
[37] Radisic M, Yang L, Boublik J, Cohen R J, Langer R, Freed L Eand Vunjak-Novakovic G 2004 Medium perfusion enablesengineering of compact and contractile cardiac tissue Am. J.Physiol.—Heart Circ. Physiol. 286 507–16
[38] Dahlin R L, Meretoja V V, Ni M, Kasper F K and Mikos A G2012 Design of a high-throughput flow perfusion bioreactorsystem for tissue engineering Tissue Eng. C 18 817–20
[39] Gabetti S et al 2022 An automated 3D-printed perfusionbioreactor combinable with pulsed electromagnetic fieldstimulators for bone tissue investigations Sci. Rep. 12 13859
[40] Yamada S, Yassin M A, Schwarz T, Mustafa K andHansmann J 2022 Optimization and validation of acustom-designed perfusion bioreactor for bone tissueengineering: flow assessment and optimal cultureenvironmental conditions Front. Bioeng. Biotechnol.10 811942
[41] Nsiah B A, Ahsan T, Griffiths S, Cooke M, Nerem R M andMcDevitt T C 2014 Fluid shear stress pre-conditioningpromotes endothelial morphogenesis of embryonic stemcells within embryoid bodies Tissue Eng. A 20 954–65
[42] Blagovic K, Kim L Y and Voldman J 2011 Microfluidicperfusion for regulating diffusible signaling in stem cellsPLoS One 6 8
[43] Nath S C, Day B, Harper L, Yee J, Hsu C Y-M, Larijani L,Rohani L, Duan N, Kallos M S and Rancourt D E 2021 Fluidshear stress promotes embryonic stem cell pluripotency viainterplay between β-catenin and vinculin in bioreactorculture Stem Cells 39 1166–77
[44] Wang Z, Oron E, Nelson B, Razis S and Ivanova N 2012Distinct lineage specification roles for NANOG, OCT4, andSOX2 in human embryonic stem cells Cell Stem Cell10 440–54
[45] Zhang X et al 2009 A role for NANOG in G1 to S transitionin human embryonic stem cells through direct binding ofCDK6 and CDC25A J. Cell Biol. 184 67
[46] Watanabe K et al 2007 A ROCK inhibitor permits survival ofdissociated human embryonic stem cells Nat. Biotechnol.25 681–6
[47] Kim K et al 2020 3,2′ -Dihydroxyflavone improves theproliferation and survival of human pluripotent stem cellsand their differentiation into hematopoietic progenitor cellsJ. Clin. Med. 9 3
[48] Pallardó F V, Markovic J, García J L and Vi˜na J 2009 Role ofnuclear glutathione as a key regulator of cell proliferationMol. Aspects Med. 30 77–85
[49] Ting S, Chen A, Reuveny S and Oh S 2014 An intermittentrocking platform for integrated expansion anddifferentiation of human pluripotent stem cells tocardiomyocytes in suspended microcarrier cultures Stem CellRes. 13 202–13
[50] Correia C et al 2014 Combining hypoxia and bioreactorhydrodynamics boosts induced pluripotent stem celldifferentiation towards cardiomyocytes Stem Cell Rev. Rep.10 786–801
[51] Badenes S M, Fernandes T G, Cordeiro C S M, Boucher S,Kuninger D, Vemuri M C, Diogo M M and Cabral J M S2016 Defined essential 8TM medium and vitronectinefficiently support scalable xeno-free expansion of humaninduced pluripotent stem cells in stirred microcarrier culturesystems PLoS One 11 e0151264
[52] Ackermann M et al 2018 Bioreactor-based mass productionof human iPSC-derived macrophages enablesimmunotherapies against bacterial airway infections Nat.Commun. 9 1–13
[53] Lock L T and Tzanakakis E S 2009 Expansion anddifferentiation of human embryonic stem cells to endodermprogeny in a microcarrier stirred-suspension culture TissueEng. A 15 2051–63
[54] Park Y, Chen Y, Ordovas L and Verfaillie C M 2014 Hepaticdifferentiation of human embryonic stem cells onmicrocarriers J. Biotechnol. 174 39–48
[55] Qiu L, Lim Y M, Chen A K, Reuveny S, Oh S K W, Tan E Kand Zeng L 2016 Microcarrier-expanded neural progenitorcells can survive, differentiate, and innervate host neuronsbetter when transplanted as aggregates Cell Transplant.25 1343–57
[56] Hove J R, Köster R W, Forouhar A S, Acevedo-Bolton G,Fraser S E and Gharib M 2003 Intracardiac fluid forces arean essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesisNature 421 172–7
[57] Courchaine K, Rykiel G and Rugonyi S 2018 Influence ofblood flow on cardiac development Prog. Biophys. Mol. Biol.137 95
[58] Conrad L et al 2021 The biomechanical basis of biasedepithelial tube elongation in lung and kidney developmentDevelopment 148 9
[59] Lorenz L et al 2018 Mechanosensing by β1 integrin inducesangiocrine signals for liver growth and survival Nature562 128–32
[60] Ng W H et al 2022 Recapitulating human cardio-pulmonaryco-development using simultaneous multilineagedifferentiation of pluripotent stem cells eLife 11 e67872
[61] Skylar-Scott M A, Huang J Y, Lu A, Ng A H M, Duenki T,Liu S, Nam L L, Damaraju S, Church G M and Lewis J A2022 Orthogonally induced differentiation of stem cells forthe programmatic patterning of vascularized organoids andbioprinted tissues Nat. Biomed. Eng. 6 449–62
[62] Giacomelli E, Bellin M, Sala L, van Meer B J, Tertoolen L G J,Orlova V V and Mummery C L 2017 Three-dimensionalcardiac microtissues composed of cardiomyocytes andendothelial cells co-differentiated from human pluripotentstem cells Development 144 1008–17
[63] Wu F, Wu D, Ren Y, Huang Y, Feng B, Zhao N, Zhang T,Chen X, Chen S and Xu A 2019 Generation of hepatobiliaryorganoids from human induced pluripotent stem cells J.Hepatol. 70 1145–58
[64] Jin G, Floy M E, Simmons A D, Arthur M M and Palecek S P2021 Spatial stem cell fate engineering via facile morphogenlocalization Adv. Healthcare Mater. 10 2100995
[65] Kilian D, Cometta S, Bernhardt A, Taymour R, Golde J,Ahlfeld T, Emmermacher J, Gelinsky M and Lode A 2022Core-shell bioprinting as a strategy to apply differentiationfactors in a spatially defined manner inside osteochondraltissue substitutes Biofabrication 14 1
[66] Freyer N, Greuel S, Knöspel F, Strahl N, Amini L, Jacobs F,Monshouwer M and Zeilinger K 2017 Effects of co-culturemedia on hepatic differentiation of hiPSC with or withoutHUVEC co-culture Int. J. Mol. Sci. 18 1724
[67] Davies P F 2009 Hemodynamic shear stress and theendothelium in cardiovascular pathophysiology Nat. Clin.Pract. Cardiovasc. Med. 6 16–26
[68] Kinstlinger I S, Calderon G A, Royse M K, Means A K,Grigoryan B and Miller J S 2021 Perfusion andendothelialization of engineered tissues with patternedvascular networks Nat. Protocols 16 3089–113
[69] Galie P A, Nguyen D H T, Choi C K, Cohen D M, Janmey P Aand Chen C S 2014 Fluid shear stress threshold regulatesangiogenic sprouting Proc. Natl Acad. Sci. USA 111 7968–73
隨著3D生物打印和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)的出現(xiàn)，組織工程領(lǐng)域發(fā)展迅速，但由于缺乏功能豐富的厚組織，影響有限。繞過這一限制的方法之一是用含有 hiPSCs 的3D 生物打印組織。通過這種方式，iPSCs可以在實質(zhì)細(xì)胞分化之前增殖并填充厚組織塊。在這里,我們設(shè)計了一個灌注生物反應(yīng)器，用于裝載hipsc的3d生物打印室， 目的是在分化之前在 整個結(jié)構(gòu)中增殖hipsc，以產(chǎn)生厚組織模型。生物反應(yīng)器由數(shù)字光投影制成，經(jīng)過優(yōu)化，可 以在水凝膠室內(nèi)部灌注而不會泄漏，也可以在外部提供流體流動，從而最大限度地提高整 個室壁的營養(yǎng)輸送。經(jīng)過7天的培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)在3ml min-1下間歇灌注(每15分鐘15秒)，相 對于在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的類似腔室，工程組織中的干細(xì)胞集落密度增加了1.9倍。我們還觀 察到，相對于靜態(tài)對照，灌注結(jié)構(gòu)的組織壁內(nèi)的菌落分布更均勻，反映了培養(yǎng)基中營養(yǎng)物 質(zhì)的均勻分布。在流體流動的作用下，hiPSCs保持多能性和增殖性，產(chǎn)生平均約1.0 dyncm-2 的壁剪切應(yīng)力�？偟膩碚f，這些充滿希望的結(jié)果在灌注干細(xì)胞水凝膠后支持多種組織類 型的產(chǎn)生，并改善了厚度，因此增加了功能和實用性。
1. 介紹
三維（3D）生物打印技術(shù)為創(chuàng)建人體疾病模 型提供了巨大的潛力，可以在體外對疾病機(jī)制、 進(jìn)展和治療進(jìn)行器官級研究。生物打印還可以生 成功能性替代組織，用于治療各種疾病。然而， 人體每個器官都有數(shù)十億個細(xì)胞，要獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞來創(chuàng)建具有代表性的體外組織并非易事 。雖然擠壓生物打印的細(xì)胞密度通常高于其他打 印方式，但目前通常只能達(dá)到每毫升生物墨水?dāng)?shù) 千萬個細(xì)胞的規(guī)模[1]。目前正在開發(fā)使用球體 或胚狀體進(jìn)行無支架生物打印的方法[2-4]，從而提高打印組織的細(xì)胞密度。然而，除了自身的一系列局限性（包括球形變異性、可打印性和打印分辨率方面的挑戰(zhàn)）外，這些方法仍然需要細(xì)胞放大和大容量培養(yǎng)基才能達(dá)到生理密度。為了解決工程組織中細(xì)胞密度低的問題，人們引入了原位干細(xì)胞擴(kuò)增和分化的生物打印方法[5-11]。在這種方法中，被打印在生物墨水中的是干細(xì)胞而不是實質(zhì)細(xì)胞。干細(xì)胞在分化成所需細(xì)胞類型之前，可在工程組織中擴(kuò)增。這對涉及增殖或遷移能力有限的細(xì)胞類型（如心肌細(xì)胞）的應(yīng)用尤其有益，也可作為使用源自患者的原始細(xì)胞的替代方法[5, 12, 13]。這種方法的另一個優(yōu)點是，在分化過程中形成的關(guān)鍵細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和 ECM-ECM 連接可以保持不變，不會被破壞。這一點非常重要，因為 ECM 組織對工程心臟組織的功能至關(guān)重要[14]。此外，在原位分化過程中形成并保存在三維生物打印結(jié)構(gòu)中的微環(huán)境可實現(xiàn)人腔肌泵（hChaMP）的組織和心臟功能[5]。使用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）打印的hChaMP 是由一種生物墨水生成的，這種墨水含有專門針對 hiPSC 生長和分化為心肌細(xì)胞而優(yōu)化的 ECM。hiPSCs 在心肌細(xì)胞分化前增殖兩周，從而使結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞密度更符合生理要求。因此，hChaMP 在整個結(jié)構(gòu)中顯示出連續(xù)的肌肉功能，這一點可以通過光學(xué)繪圖和肌肉組織每次收縮時泵送液體的能力來證明。然而，雖然使用干細(xì)胞進(jìn)行生物打印以及隨后的擴(kuò)增和分化是一項很有前景的技術(shù)，但由于營養(yǎng)供應(yīng)不足，hChaMP顯示出有限的組織厚度[5]，這是組織工程領(lǐng)域眾所周知的問題。營養(yǎng)物質(zhì)（尤其是氧氣）的供應(yīng)限制了工程組織的厚度，通常只能達(dá)到 100-200 微米的存活組織[15]。然而，有了流體流動，就可以通過對流擴(kuò)大營養(yǎng)物質(zhì)的獲取，從而開發(fā)出許多用于工程組織的生物反應(yīng)器[16, 17]。由于多能干細(xì)胞對微環(huán)境敏感，而剪切應(yīng)力已被證明可誘導(dǎo)小鼠干細(xì)胞造血[18]，并促進(jìn)干細(xì)胞衍生前體形成內(nèi)皮細(xì)胞[19, 20]，因此在工程組織中對流擴(kuò)增hiPSC可能會誘發(fā)無意分化。相反，許多生物反應(yīng)器研究表明，利用流體力學(xué)擴(kuò)增干細(xì)胞聚集體或微載體，其效力損失有限[21-25]。在此，我們介紹了為hChaMP開發(fā)的灌注生物反應(yīng)器。我們的研究表明，間歇灌注hChaMP可使細(xì)胞密度在培養(yǎng)一周后增加近兩倍。
此外，盡管暴露在剪切應(yīng)力下，hiPSCs仍能保持多能性，而剪切應(yīng)力近似低于其他常見的干細(xì)胞擴(kuò)增生物反應(yīng)器。這些結(jié)果表明，擴(kuò)增的iPSCs分化成所需細(xì)胞類型后，有望生成厚組織模型。
2. 材料與方法
2.1. hChaMP制造
通過Autodesk Meshmixer和Blender（圖1(a)），根據(jù)之前報道的結(jié)構(gòu)[5]重新設(shè)計了hChaMPs ，并在Slic3r中生成了g代碼。打印前一天，在含有 75% mTeSR1（STEMCELLTechnologies，cat#85850）、25% 醋酸（20 mM）和1.3% 苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰（LAP，Allevi）的溶液中，將甲基丙烯酰明膠（GelMA；明尼蘇達(dá)大學(xué)生物打印設(shè)備）在60℃下重組至 26.7% w/v。甲基丙烯酸膠原（ColMA；Advanced Biomatrix，cat#5198）在 20 µM乙酸中溶解至2% w/v，溫度為37℃。打印前，混合GelMA和ColMA溶液（3:1 GelMA溶液：ColMA溶液，即 20% w/v GelMA，0.5% w/v ColMA），并用1M 氫氧化鈉中和。這些研究中使用了 hiPSCs（在肌球蛋白重鏈基因[26]下過表達(dá)細(xì)胞周期蛋白 D2，雌性）。hiPSCs 在 基底膜基質(zhì)（Corning，cat#08-774-552）上的 mTeSR1 中保存，并通過 ReLeSR（STEMCELL Technologies，cat#05872）定期傳代。打印時，用細(xì)胞消化液（Millipore Sigma，cat#A6964）將匯合度為 60%-80% 的 hiPSCs單個化。細(xì)胞懸浮液清洗后離心兩次，以除去可能降解基質(zhì)支架的多余細(xì)胞消化液。然后將細(xì)胞以 3000 萬個細(xì)胞 ml-1 的量重懸在 ECM 溶液中，該溶液含有 187 µg ml-1 小鼠層粘連蛋白/腸粘連蛋白（LN；Corning，cat#354259）、187µg ml-1 人纖連蛋白（FN；Corning，cat#356008 或 R&D systems，cat#1918-FN-02M）和10 µM Y-27632 ROCK 抑制劑（Selleckchem，cat#S1049）的 mTeSR1，并在室溫下孵育 15 分鐘。hChaMPs 在INKREDIBLE擠壓式生物打印機(jī)（CELLINK）上打印。為了提高低粘度生物墨水的分辨率，打印是在基于 FRESH v2.0[27]的支撐浴中進(jìn)行的。支撐浴是在生物安全柜中制作的，以保持無菌狀態(tài)；52.5%的無菌Milli-Q水和47.5%的乙醇混合物在輔助容器中制作的水浴中加熱到45℃。以每分鐘400轉(zhuǎn)的速度攪拌混合物，并用鋁箔覆蓋以減少蒸發(fā)。加入氫氧化鈉（1mM）使pH值升至7，然后加入B型明膠（SigmaAldrich，cat#G9382，2% w/v）和阿拉伯樹膠（Sigma Aldrich，cat#9752，1% w/v）。溶液在45℃下混合10分鐘，然后冷卻至35℃，然后緩慢冷卻至25℃(<1℃ min-1)。然后降低溫度至10℃，再攪拌5分鐘。將混合物轉(zhuǎn)移到錐形管中，在100G下離心4分鐘。將上清替換為冷的、無菌的Milli-Q水，管子旋轉(zhuǎn)，在500G下離心5分鐘。然后用冷的、無菌的1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;Fisher Scientific, cat#BP3994)，并保存在4℃，直到打印當(dāng)天。此時，在1200G下離心3分鐘，去除多余的PBS，薄層紫外線照射30分鐘。生物墨水在27°C下用27 G, 1英寸針頭打印。如前所述[5]，為了保持打印結(jié)構(gòu)的一致性(這對灌注設(shè)置很重要)，壓力根據(jù)針頭的墨水滴速而變化。對于給定的打印結(jié)構(gòu)，這里使用的墨水，滴針之間的滴速為3.1秒。在六個面各打印20秒后，墨水與藍(lán)光(405 nm)交聯(lián)。然后將支撐液中的打印物移到培養(yǎng)箱中熔化支撐液，然后用溫暖、無菌的Dulbecco PBS (DPBS;不含Ca2+和Mg2+;Thermo Fisher Scientific，編號14190144)。hChaMPs在5µM Y-27632的mTeSR1中培養(yǎng)過夜，在靜態(tài)條件下允許細(xì)胞附著。
該設(shè)計允許灌注hChaMP 內(nèi)部(實箭頭),以及圍繞hChaMP 外部的流體流動(虛線箭頭)。hChaMP 輕輕放置在細(xì)水平桿上 ,允許在hChaMP底部周圍進(jìn)行外部灌注。(d)3d 打印生物反應(yīng)器，由螺母、螺栓和硅膠墊圈組裝而成。(e)生物反應(yīng)器 中的hChaMP。油管將hChaMP連接到生物反應(yīng)器。(f)整個灌注裝置，生物反應(yīng)器連接到泵和介質(zhì)儲存器。
2.2. hChaMP 灌注
在SOLIDWORKS中設(shè)計生物反應(yīng)器，其中hChaMP內(nèi)部灌注端口(Ini和Outi)和hChaMP外部流動端口(Ine和Oute)(圖1(c))。生物反應(yīng)器通過Perfactory IV數(shù)字光投影打印機(jī)(EnvisionTEC)使用E-shell 300 (EnvisionTEC,cat#1500300)進(jìn)行3d打印(圖1(d))。灌注時，使用Masterflex L/S標(biāo)準(zhǔn)數(shù)字驅(qū)動器(cat#07522-30)與Masterflex L/S 14鉑固化硅膠管(1.6 mm ID, cat#96410-14)。培養(yǎng)基儲液器是一個50 ml的錐形管，蓋子上有三個孔，兩個用于流體的進(jìn)出口，一個用于0.22µm注射器過濾器(Whatman, cat#6780-2502)，允許在培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌氧氣交換。培養(yǎng)基儲層最初填充兩倍體積的培養(yǎng)基(mTeSR Plus [STEMCELLTechnologies, cat#100-0276])，并添加100 μml - 1青霉素，100 μ ml - 1鏈霉素[penp -strep;Thermo Fisher Scientific, cat#15140122]用于灌注的第一天)，而不是管道和生物反應(yīng)器中所需的系統(tǒng)。這樣，在隨后的日子里，只需簡單地更換錐形管，就可以更換 50%的培養(yǎng)基（mTeSR Plus，no pen-strep），從而最大限度地減少排空管道時可能發(fā)生的污染和氣泡形成。靜態(tài)對照在具有等量培養(yǎng)基的立式T25燒瓶中培養(yǎng)，每天也更換50%的培養(yǎng)基。
打印1天后開始灌注。生物反應(yīng)器在生物安全柜中紫外線照射下，70%乙醇浸泡30分鐘滅菌。然后用無菌的1X PBS洗滌生物反應(yīng)器三次。為了準(zhǔn)備hChaMP進(jìn)行灌注(圖S1)，將hChaMP移至有溫DPBS的培養(yǎng)皿中。硅膠管(15mm長，2mm內(nèi)徑，3mm外徑;將uxcell (cat#a19011600ux0295)插入hChaMP的兩條血管中。將插入管的hChaMP移至干凈、干燥的培養(yǎng)皿中，在管和hChaMP的界面處移液無菌的20% GelMA(含0.5% w/v LAP，如上所述溶解于mTeSR1和乙酸中)，同時用藍(lán)光交聯(lián)。將hChaMP移動到充滿DPBS的生物反應(yīng)器中，使用無菌細(xì)齒鉗將管的另一端插入生物反應(yīng)器通道中(圖1(e))。20%的GelMA被添加到每根油管的兩端，以形成防止泄漏的密封。Outi的管(Masterflex C-Flex管，3.2 mm ID，編號06422-04)充滿DPBS，并連接到生物反應(yīng)器上，以消除Outi的表面張力，這種張力會產(chǎn)生壓差，阻礙hChaMP的灌注。為了檢查內(nèi)部灌注是否有泄漏，用食用色素染色的DPBS(通過0.22µm過濾器過濾)用注射器和針頭注射到Ini。如果油管連接處存在泄漏，則使用20%以上的GelMA。染色的DPBS用mTeSR Plus溫水沖洗。然后將生物反應(yīng)器連接到灌注裝置上。將生物反應(yīng)器連接到引管上，在生物反應(yīng)器上放置30mm硅膠墊片，并用螺母和螺栓固定生物反應(yīng)器蓋。將泵打開至3ml min - 1，以去除生物反應(yīng)器中剩余的空氣。將灌注設(shè)置(圖1(f))移至培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)，并將流量改為間歇，每15分鐘以3ml min - 1的速度流動15 s。每天進(jìn)行50%的介質(zhì)更換，直到灌注結(jié)束。
2.3. 計算模擬
為了建立 hChaMP 中流體流動的計算模型，在生物反應(yīng)器的入口和出口處測量了流動下的壓力。簡言之，如上所述，將無細(xì)胞 hChaMP 插入生物反應(yīng)器并連接流動。在生物反應(yīng)器入口或出口的底部放置止血閥（Qosina，cat#80395），以便在設(shè)置中插入壓力導(dǎo)管。使用 ADV500 PV系統(tǒng)和 1.4 Fr 壓力導(dǎo)管（Transonic）測量壓力曲線，數(shù)據(jù)采集采樣率為 5000 Hz。在Simvascular中使用流固相互作用(FSI)方法來解析內(nèi)部流動[28]。根據(jù)實驗結(jié)果，采用彈性模量為1.96 kPa的新hookean模型來描述墻。流體模型采用牛頓流體模型，粘度為1 cP，用波形描述進(jìn)口的間歇流動，并在出口施加與實驗結(jié)果相匹配的壓力作為邊界條件。為了穩(wěn)定系統(tǒng)中的壓力，在明尼蘇達(dá)超級計算研究所進(jìn)行了十個周期的模擬。外部流動使用Ansys Fluent, release 20.1進(jìn)行求解，假設(shè)墻壁是剛性的。與內(nèi)部流動模擬一樣，將流體描述為粘度為1 cP的牛頓流體，并施加一個波形作為進(jìn)口邊界條件，其流量與內(nèi)部流動模擬的出口結(jié)果相匹配。出口設(shè)為零參考壓力。
2.4.冷凍切片和免疫熒光(IF)染色
培養(yǎng)7天后，去除hChaMP底部(頂端)進(jìn)行核糖核酸(RNA)提取(見下文)。剩余的hChaMP在4℃下用4%多聚甲醛固定過夜。第二天，hChaMPs用1X PBS洗滌三次。hChaMP腔室(在血管和切除的頂點之間)被切成兩部分，以便從結(jié)構(gòu)的不同區(qū)域進(jìn)行切片。切片前，樣品在30% w/v蔗糖的PBS中4?C孵育2 d。為了準(zhǔn)備冷凍樣品，將樣品移動到30%蔗糖:O.C.T.的1:1混合物中化合物(Tissue-Tek，編號25608-930)孵育1.5小時，然后在O.C.T.化合物中低溫模孵育3小時。然后將樣品在-80℃下冷凍。使用徠卡CM1900低溫恒溫器對樣品進(jìn)行10µm厚度的切片。將載玻片置于室溫下過夜，第二天使用或移至- 20℃。為了通過hChaMP成像細(xì)胞分布，切片用5µg ml?1 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, Invitrogen, cat#D1306)染色8分鐘，然后用DAPI/1,4-重氮雜環(huán)[2,2,2]辛烷(DABCO;Sigma-Aldrich, cat#D27802)在甘油和PBS。在徠卡DMi8熒光顯微鏡下，將載玻片成像為瓦片。為了量化ImageJ中的菌落密度，使用瓦片掃描明場圖像跟蹤切片的邊緣，將dapi標(biāo)記的瓦片掃描進(jìn)行二值化，并使用Analyze Particles功能識別大于或等于1000µm2的細(xì)胞菌落。每個hChaMP分析了5個切片。通過在明場切片(菌落不容易可視化的地方)上沿著每個切片的厚度(從室外到室內(nèi))繪制10條線來定量分布，然后沿著每條線找到二值化DAPI的Plot Profile。在Microsoft Excel中分析剖面，以確定在組織厚度的每五分之一段內(nèi)發(fā)生的情況。平均壁厚計算為所有線的平均長度。對于IF，用0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, cat#T8787)滲透1小時，用5%牛血清白蛋白、1%甘氨酸、2%山羊血清和0.1% Triton X-100 (BGST)的溶液阻斷2小時。在BGST中，一級抗體(1µg ml-1小鼠anti-OCT3/4 [Santa CruzBiotechnology, cat#sc-5279]， 5µg ml-1小鼠anti-KI67 [BD Biosciences, cat#556003]，和2.5µg ml-1兔 anti-PAX6 [Invitrogen, cat#42-6600]，圖S2)在4℃下在切片上孵育過夜。在次級抗體(4µg ml-1 AlexaFluor 647羊 anti-mouse[Invitrogen, cat#A21236]或AlexaFluor 647羊anti-rabbit [Invitrogen, cat#A32733])中孵育2小時前，用0.2% Tween-20 (Millipore, cat#655204)在1XPBS中洗滌2次，用1XPBS洗滌1次。樣品再次用Tween-20和PBS洗滌，然后用DAPI染色，并如上所述用DAPI/DABCO涂載。采集菌落20×圖像，在ImageJ中定量熒光標(biāo)記面積。具體來說，DAPI圖像是二值化的，并且使用AnalyzeParticles特征來跟蹤集落邊界，作為集落小于1000µm2的感興趣區(qū)域(roi)。然后對相應(yīng)的IF圖像進(jìn)行二值化處理，將每個ROI內(nèi)標(biāo)記物覆蓋的面積量化歸一化為相應(yīng)ROI內(nèi)的DAPI密度。對于每個標(biāo)記，每個hChaMP分析了>30個菌落。
2.5. RT-qPCR
用刀片輕輕去除hChaMPs的頂端，并在液氮罐中快速冷凍，以備將來提取RNA。樣品裂解并使用PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen，編號12183018A)分離RNA。使用Gen5軟件在Cytation3成像閱讀器(BioTek)上定量RNA的質(zhì)量和數(shù)量。cDNA使用SuperScript IV VILO MasterMix (Invitrogen, cat#11756050)根據(jù)制造商的說明創(chuàng)建。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)使用PowerSYBR Green Master Mix (1X,Applied Biosystems, cat#4367659)在RocheLightCycler 96(多能性標(biāo)記，60°C退火)或Eppendorf Mastercycler ep realplex2(胚層標(biāo)記，55°C退火)上進(jìn)行30個循環(huán)。標(biāo)記物的表達(dá)被標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。引物序列來源于文獻(xiàn)(Integrated DNA Technologies，表S1)，并根據(jù)primer-blast[29]中所關(guān)注基因的特異性和低二聚化可能性，根據(jù)Integrated DNATechnologies 的 OligoAnalyzer Tool 選擇引物對。陽性對照的hipsc衍生的胚層組織如補(bǔ)充信息中所述。
2.6. 統(tǒng)計
每種情況下測試三個hChaMPs。在JMP Pro16.0中進(jìn)行樣本組比較。對不相等均值(雙尾)的零假設(shè)計算p值，置信區(qū)間為95%。采用學(xué)生t檢驗計算靜態(tài)和灌注hChaMPs的p值，而RT-qPCR的多個條件采用方差分析(ANOVA)檢驗和事后Tukey-Kramer誠實顯著性差異(HSD)檢驗進(jìn)行比較。
3. 結(jié)果
3.1. 生物反應(yīng)器的設(shè)計與灌注參數(shù)的選擇為灌注設(shè)計的hChaMP結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示(視頻S1)。該結(jié)構(gòu)在先前報道的結(jié)構(gòu)[5]基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，作為單個心室，允許未來通過施加流體流動和機(jī)械閥驅(qū)動來建模心室功能(即泵送)。hChaMP是通過擠壓打印的生物打印(圖1(b))，由含有hiPSCs(1500萬ml - 1細(xì)胞)、明膠甲基丙烯酰(GelMA)、甲基丙烯化膠原蛋白、層粘連蛋白/腸動蛋白和纖維連接蛋白的生物墨水形成。由于ecm支架的微妙性質(zhì)，其存儲模量為1.79±0.13 kPa(圖S3)，因此設(shè)計了一個生物反應(yīng)器來支持hChaMP在整個灌注過程中(圖1(c) - (e))。短管被用作hChaMP和生物反應(yīng)器之間的連接。將管插入hChaMP中，在連接處加入無菌的20%GelMA并光交聯(lián)以將管密封到位。該生物反應(yīng)器包含一個隔間，用于穩(wěn)定定位hChaMP，并具有兩個通道，用于插入連接到hChaMP的管道。生物反應(yīng)器被設(shè)計成適當(dāng)?shù)匾龑?dǎo)流體通過hChaMP的內(nèi)部，然后繞過外部(圖1(c)和視頻S2-S3)，以最大限度地實現(xiàn)營養(yǎng)交換。為了減少通過hChaMP的流體阻力，Outi比Ini大。從Outi流出的水流流入Ine, Ine進(jìn)入hChaMP下方的生物反應(yīng)器隔間，并從hChaMP上方的蓋子流出Oute(圖1(c)和視頻S3)。在完成提供內(nèi)部和外部流動的生物反應(yīng)器設(shè)計后，考慮灌注流速。每30-60分鐘灌注1分鐘，這種不頻繁的灌注方式導(dǎo)致細(xì)胞生長很少，可能是由于生物反應(yīng)器和hChaMP內(nèi)缺乏氧氣交換以及廢物去除有限。因此，采用每15分鐘15 s的間歇灌注。這種流動的持續(xù)時間允許在hChaMP內(nèi)部完全改變介質(zhì)，并且頻率支持組織內(nèi)的細(xì)胞存活。
圖2所示。流體流動特性。(a)，(b)通過顆粒跟蹤(a)和計算流體動力學(xué)(b)總結(jié)了hChaMP腔室的流動模式。(c)計算模型提供了灌注對hChaMP內(nèi)壁速度、壓力和壁面剪切應(yīng)力的影響。(d) hChaMP外部的流動概況，用藍(lán)色食用色素染色的DPBS進(jìn)行演示。相對于流經(jīng)hChaMP內(nèi)部的流體，外部的流體流動速度較慢。(e) hChaMP外周流場計算模型。(f)由外部流體流動引起的壓力和壁面剪應(yīng)力的計算近似值(此處流動方向為從左到右)。
值得注意的是，在生物反應(yīng)器中對hChaMP施加壓力增加的情況下，泄漏將持續(xù)發(fā)生在管道-hChaMP界面。這種壓力限制限制了該模型在下游應(yīng)用中的實用性，因為當(dāng)接口處存在泄漏時，hChaMP無法達(dá)到更高的壓力。因此，我們探索了提高軟組織對疏水管粘附性的方法。經(jīng)3-(三甲氧基硅基)甲基丙烯酸丙酯預(yù)處理(補(bǔ)充方法，圖S5(a))，油管與添加在油管- hchamp界面的GelMA的結(jié)合得到改善。這使得界面可以承受更高的壓力，hChaMP本身在破裂前的最大壓力達(dá)到16.8±0.6 mmHg(圖S5(b)， (c)和視頻S4)。這是系統(tǒng)使用蠕動泵(~ 8.2 mmHg)時的平均壓力的兩倍。然而，這個最大壓力或“爆裂”壓力被發(fā)現(xiàn)低于蠕動泵施加的最大壓力(~ 27.1 mmHg)。這種差異可歸因于蠕動泵的振蕩壓力，其中低壓和高壓的快速波動導(dǎo)致hChaMP的膨脹和收縮(視頻S3)。在爆炸試驗中，壓力被緩慢地直接施加到hChaMP壁上，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不斷膨脹(圖S5(b)和視頻S4)，直到壁上變得太弱而無法容納更多的流體。
3.2. 流體流動參數(shù)的近似值
為了近似計算流體流動對hChaMP的影響，特別是在hChaMP壁面處的壓力和剪切應(yīng)力，進(jìn)行了計算模擬。將壓力導(dǎo)管插入Ini或Outi底部的止血閥，測量hChaMP入口和出口的壓力分布。在計算模型中，將測量到的壓力剖面的最大值、最小值和平均值作為hChaMP流動的輸入。SimVascular svFSI求解器是一款專門用于心血管模擬的開源軟件[28]，用于求解hChaMP的內(nèi)部流動曲線。該軟件之前已經(jīng)在體外模型中進(jìn)行了驗證，并證明了其在描述流動動力學(xué)方面的有效性[30]。使用該軟件和hChaMP的3D模型，流體流動曲線與體外實驗的結(jié)果相匹配(圖2(b)、S4和視頻S2)，證實了該模型復(fù)制系統(tǒng)的能力。這允許計算在hChaMP內(nèi)壁上產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，這是干細(xì)胞培養(yǎng)的一個關(guān)鍵參數(shù)。
發(fā)現(xiàn)hChaMP內(nèi)的壓力相當(dāng)均勻，在單個泵循環(huán)中的變化與實驗值相匹配，平均約為4.5-5.3mmHg，最大值為25.5 mmHg(圖2(c))。壓力在其最小值為負(fù)，反映了在泵的脈動循環(huán)中所看到的情況。在灌注數(shù)天后，這種壓力的變化似乎沒有引起hChaMP完整性的問題。壁面剪切應(yīng)力變化較小，平均值約為1.0 dyn cm-2，在大部分hChaMP腔室中最大值為2.7 dyn cm-2，盡管在Outi附近隨著流體流出腔室急劇增加，達(dá)到15.0 dyn cm-2(圖2(c))。
由于外流存在復(fù)雜的幾何形狀，采用AnsysFluent求解外流廓線。Fluent是開源軟件SimVascular的商業(yè)替代品，已被廣泛用于心血管系統(tǒng)的流體流動模式演示，包括體外模型[31]。求解了外流動廓形，實現(xiàn)了hChaMP外壁面剪應(yīng)力的計算。外部的壓力和壁面剪切應(yīng)力要低得多，這可能是由于生物反應(yīng)器的大隔間尺寸和從Outi到Ine的壓力下降，導(dǎo)致hChaMP周圍的流量較低(圖2(d) - (f))。
有趣的是，外部的壓力取決于所分析的位置。流體首先與hChaMP接觸的下側(cè)最大壓力高于上側(cè);然而，兩者的差別相當(dāng)小，底部的最大壓力為1.13 × 10-4 mmHg，上部的最大壓力為1.05× 10-4 mmHg。與內(nèi)部流動的壓力相似，hChaMP外部的最小壓力略為負(fù)，但在10 - 6 mmHg的量級上。墻體剪應(yīng)力也遠(yuǎn)低于內(nèi)部，范圍在10-7 -10-5 dyn cm?2之間(圖2(f))。總體而言，內(nèi)壁剪切應(yīng)力與干細(xì)胞擴(kuò)增的普通生物反應(yīng)器的剪切應(yīng)力范圍相似，而外部剪切應(yīng)力遠(yuǎn)低于其值，據(jù)報道約為0.7 - 2.5 dyn cm-2[32-34]。此外，發(fā)現(xiàn)水凝膠中嵌入的干細(xì)胞能夠承受大于30 dyn cm-2的應(yīng)力[22]，這表明我們設(shè)置的剪切應(yīng)力近似于hiPSC擴(kuò)增是合理的。
3.3. 灌注對hiPSCs生長和分布的影響為了確定流體流動對hiPSC增殖和分布的影響，在打印后1 d將hChaMPs插入生物反應(yīng)器中進(jìn)行灌注，使細(xì)胞有時間附著在結(jié)構(gòu)上(圖3(a))。隨后的每一天，錐形管作為介質(zhì)儲存庫替換為新鮮介質(zhì)。油管中的介質(zhì)，大約相當(dāng)于系統(tǒng)中總體積的一半，沒有被排干，以防止污染或氣泡進(jìn)入系統(tǒng)。因此，每天使用mTeSR Plus更換50%的培養(yǎng)基。隨著組織工程中的生物制造技術(shù)變得越來越復(fù)雜，污染風(fēng)險也隨之增加。然而，干細(xì)胞一般避免使用抗生素，即使是短期治療也是如此[35]。在這里，青霉素鏈霉素在灌注的第一天加入，并在隨后的培養(yǎng)基更換中逐漸稀釋。在這種情況下，短期暴露于青霉素-鏈霉素對三維培養(yǎng)中單一化hiPSCs的增殖和效力沒有影響（圖S6）。
圖3所示。灌注可改善hiPSC菌落的覆蓋和分布。(a) hChaMP增殖時間線，打印后第1天開始間歇灌注。(b) hChaMP橫 截面，用DAPI染色(白色)顯示培養(yǎng)7 d后，灌注或不灌注時整個hChaMP的細(xì)胞密度。(c)與靜態(tài)對照相比，灌注樣品中 hChaMP中的菌落密度增加了一倍。(d)間歇灌注不影響壁厚。(e)在hChaMP細(xì)胞壁上劃線，在ImageJ中進(jìn)行處理，確定 菌落在細(xì)胞壁上的分布。灌注后的hChaMPs與靜態(tài)hChaMPs相比，壁中部的菌落明顯增加。在組織壁各區(qū)域進(jìn)行靜態(tài)和灌注hChaMPs的比較。n = 3 hChaMPs。統(tǒng)計上不顯著;#p < 0.1，*p < 0.05，**p < 0.01)。
圖4。hiPSCs在灌注后仍能保持多能性和增生性。(a)、(b)灌注后的hChaMPs細(xì)胞中，OCT3/4 (a)和KI67 (b)的表達(dá)仍 然很高，與靜態(tài)對照細(xì)胞相當(dāng)。n = 3個hChaMP，每個hChaMP >30個菌落。(c) RT-qPCR證實，與陰性(hiPSC)和陽性對照(hiPSC衍生的中胚層、內(nèi)胚層或外胚層)相比，多能性標(biāo)記物OCT4、NANOG和SOX2的高表達(dá)和胚層標(biāo)記物的低表達(dá)相對于GAPDH的表達(dá)。(d) PAX6蛋白在靜態(tài)和灌注hChaMPs中均未表達(dá)，但在胚層陽性對照中表達(dá)較低。運(yùn)動神經(jīng)元(分化第12天)作為參考，高水平的熒光信號對應(yīng)于PAX6的高表達(dá)。不重要的;*p < 0.05,**p < 0.01,***p?0.001,****p < 0.0001)。
hChaMPs流式培養(yǎng)6天，打印后總培養(yǎng)時間為7天，然后固定并冷凍切片分析。DAPI染色(圖3(b))用于確定活細(xì)胞菌落的大小和位置。在之前的工作中(圖S7)，我們發(fā)現(xiàn)不屬于菌落一部分的細(xì)胞是不可存活的，因為它們可能在制造所需的單化過程中死亡，并且仍然被包裹在工程組織中。基于這些標(biāo)準(zhǔn)，我們發(fā)現(xiàn)灌注結(jié)構(gòu)的hiPSC菌落密度相對于靜態(tài)培養(yǎng)基中的對照組增加了1.9倍(圖3(c))。對切片組織進(jìn)行檢查，以驗證流動對hChaMP完整性沒有影響。靜態(tài)和灌注的hChaMPs保持一致的壁厚，約為1.2-1.4 mm(圖3(d))。此外，與靜態(tài)培養(yǎng)的hChaMPs相比，灌注hChaMPs改善了hiPSC菌落在細(xì)胞壁內(nèi)的分布(圖3(e))。灌注的hChaMPs中，大多數(shù)hipsc位于組織壁的中部，在組織壁的不同區(qū)域間菌落數(shù)量變化較小。另一方面，靜態(tài)對照的菌落位于hChaMP外側(cè)附近，在整個組織中的分布較少。有趣的是，灌注和靜態(tài)hChaMP在hChaMP最外層的菌落百分比相對于下一個內(nèi)部部分都要低。這可能是由于在支撐槽移除和介質(zhì)改變或灌注過程中細(xì)胞丟失所致。3.4. 灌注對hiPSC多能性的影響為了測試來自流體流動的剪切應(yīng)力是否會導(dǎo)致hiPSCs的不良分化，對hChaMPs的冷凍切片進(jìn)行OCT3/4 IF染色(圖4(a))。集落的定性和定量分析表明，幾乎所有細(xì)胞都保持多能性，多能性與靜態(tài)對照相當(dāng)。此外，細(xì)胞高度增殖，KI67在整個菌落中呈陽性表達(dá)(圖4(b))。這表明hipsc在間歇灌注后仍保持其多能性和自我更新特性。接下來，使用RT-qPCR來量化多能性標(biāo)記，以及來自每個胚層的標(biāo)記，以在轉(zhuǎn)錄物水平上確認(rèn)我們的結(jié)果(圖4(c))。與2D培養(yǎng)的hiPSC對照相比，在靜態(tài)和灌注狀態(tài)下，OCT4、NANOG和SOX2的表達(dá)均保持較高水平�？偟膩碚f，除了一個例外，沒有檢測到胚層標(biāo)記物，或者發(fā)現(xiàn)相對
于hiPSCs或靜態(tài)hChaMPs的水平不顯著。外胚層標(biāo)志物PAX6在灌注hChaMP細(xì)胞中的表達(dá)高于2DhiPSCs (p=0.044)。然而，IF染色顯示PAX6在hChaMPs中沒有蛋白水平的表達(dá)(圖4(d))。
4. 結(jié)論在這里，我們展示了灌注hiPSCladen生物打印組織的能力，目的是增加工程組織的活細(xì)胞厚度。僅培養(yǎng)7天后，灌注就能顯著提高菌落密度，這是我們通常hChaMP增殖周期的一半。先前的灌注生物反應(yīng)器研究[36-40]發(fā)現(xiàn)，使用原代細(xì)胞類型可以提高組織內(nèi)的生存能力，而我們能夠使用對環(huán)境高度敏感的多能干細(xì)胞復(fù)制結(jié)果。此外，這些先前的研究通常是直接通過支架的孔隙向組織間質(zhì)灌注。在這里，我們展示了在組織周圍而不是直接通過組織的大體積流體流動中獲得類似結(jié)果的能力。因此，本文所描述的與最佳生物反應(yīng)器設(shè)計、通過精致水凝膠腔灌注以及hipsc的流動考慮相關(guān)的概念將為潛在的任何組織類型的研究鋪平道路。在這種結(jié)構(gòu)分化后，可以產(chǎn)生較厚的組織，并伴隨組織功能的增加。
生物反應(yīng)器的開發(fā)是一個反復(fù)的過程，成功增殖的最重要參數(shù)是對軟水凝膠的精細(xì)處理和連接處的防泄漏，以確保通過hChaMP內(nèi)部進(jìn)行灌注。早期嘗試以垂直、直立的姿勢灌注hChaMP，成功地提高了細(xì)胞在內(nèi)部的活力。然而，難以設(shè)置hChaMP進(jìn)行灌注，并且需要一個小的隔間尺寸來保持hChaMP，最大限度地減少了hChaMP周圍的營養(yǎng)物質(zhì)體積，使得這些生物反應(yīng)器設(shè)計不切實際。因此，目前的生物反應(yīng)器設(shè)計將hChaMP放置在仰臥位置，為養(yǎng)分交換提供了簡單的設(shè)置和足夠的培養(yǎng)基體積。精細(xì)的操作仍然是灌注成功的關(guān)鍵。在hChaMP打印分辨率較差的情況下，管子插入變得更加困難，需要更嚴(yán)格的處理，導(dǎo)致培養(yǎng)第7天菌落形成急劇減少。此外，壓差在確保通過hChaMP內(nèi)部灌注方面發(fā)揮了重要作用。設(shè)計初期的一個常見問題是hChaMP油管連接處的泄漏，盡管添加了GelMA來形成密封。我們發(fā)現(xiàn)，在灌注前，必須在Outi處連接充滿DPBS的油管，以消除表面張力，這種張力會產(chǎn)生壓差，阻礙hChaMP內(nèi)部的灌注，導(dǎo)致連接處泄漏。再加上Outi相對于進(jìn)油管尺寸的增加，從本質(zhì)上解決了這個問題，促進(jìn)了流體通過hChaMP內(nèi)部的流動。翻譯生物打印方法的一個很大的限制是需要大量的細(xì)胞達(dá)到生理密度，當(dāng)工程組織的大小增加到生理尺度時，這一點尤為重要。允許細(xì)胞在原位增殖減少了對大量孔板和相應(yīng)的單層擴(kuò)增介質(zhì)體積的需求。在這里，只需要一個6孔板(1000萬個hiPSCs)就可以產(chǎn)生厘米級的hChaMP。進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)時間、打印時的細(xì)胞密度，或調(diào)整ROCK抑制劑和/或類似的生化化合物處理，可以進(jìn)一步增加分化前的hiPSC密度。增加培養(yǎng)時間可能會允許進(jìn)一步的細(xì)胞生長，但不適合擴(kuò)大規(guī)模和組織應(yīng)用。這也可能進(jìn)一步影響基因表達(dá)。在培養(yǎng)的第7天，多能性和胚層標(biāo)記物在RNA水平上幾乎沒有變化，但灌注的hChaMPs中外胚層標(biāo)記物PAX6略有增加。在蛋白水平上，PAX6未在hChaMPs中表達(dá)。這一結(jié)果與暴露于0.003 - 5 dyn cm - 2剪切應(yīng)力下的小鼠PSCs的研究一致，其中神經(jīng)標(biāo)記物的表達(dá)與靜態(tài)培養(yǎng)相當(dāng)[41,42]。與2D培養(yǎng)的hiPSCs相比，灌注的hChaMPs中NANOG RNA表達(dá)也有輕微但不顯著的增加。有趣的是，最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，在暴露于流動的小鼠iPSCs中，NANOG和OCT4的表達(dá)也有類似的增加，這可能是由于涉及E-cadherin和/或β-catenin的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)[43]。此外，在人類多能干細(xì)胞中，NANOG被認(rèn)為可以抑制外胚層的形成[44]，并通過調(diào)節(jié)進(jìn)入細(xì)胞周期的s期來增加細(xì)胞增殖[45]，這表明NANOG可能在灌注的hChaMPs中發(fā)揮有益作用。因此，需要進(jìn)一步的研究來確定長時間灌注對hiPSCs的影響。生物墨水中的細(xì)胞密度可能會進(jìn)一步優(yōu)化以增加菌落數(shù)量，但正如所討論的那樣，這受到用于打印的噴嘴尺寸的限制。另外，用10µM ROCK抑制劑Y-27632或法舒地爾治療多日可提高干細(xì)胞增殖率，s期細(xì)胞比例增加[46]。同樣，類黃酮3,2 ' -二羥黃酮(3,2 ' DHF)已被證明可以增加hiPSCs的增殖、s期細(xì)胞的百分比和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的表達(dá)[47]，這可能在細(xì)胞增殖的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用[48]。與單獨使用任何一種分子相比，3,2 ' -DHF和Y-27632聯(lián)合處理hiPSCs進(jìn)一步改善了增殖[47]，這表明有希望的方法可以與灌注結(jié)合進(jìn)一步改善細(xì)胞密度和組織厚度。在hChaMP中獲得所需的hiPSC密度后，下一步將是分化。先前的研究表明，在剪切作用下，有可能分化為中胚層[49-52]、內(nèi)胚層[53,54]和外胚層[51,55]。此外，考慮到剪切應(yīng)力在胎兒發(fā)育中的作用[56-59]，仿生血流可能有利于分化組織的功能。然而，在某些分化情況下，高水平的剪切應(yīng)力是有害的。例如，Ting等人發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞分化過程中，在搖椅上持續(xù)攪拌導(dǎo)致心肌細(xì)胞非常少;然而，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，間歇性攪拌可使分化效率提高約38%[49]。同樣，在微載體的肝臟分化中，在分化的早期階段，超過30 rpm的攪拌會導(dǎo)致細(xì)胞脫離微載體[54]。因此，生物反應(yīng)器中的分化參數(shù)需要針對所需的組織類型進(jìn)行優(yōu)化，以平衡營養(yǎng)輸送/廢物清除和維持細(xì)胞健康。作為誘導(dǎo)多系分化進(jìn)展的方法，原位hiPSC增殖的效用可以進(jìn)一步增強(qiáng)[60-65]。這種方法，從不同的支架材料特性到改變細(xì)胞因子或培養(yǎng)基成分以及基因工程hiPSCs，可以很容易地轉(zhuǎn)化為生物打印和生物反應(yīng)器設(shè)置，以獲得大量不同類型的細(xì)胞。分化為多種組織類型，可以研究發(fā)育過程中相關(guān)組織的形成，疾病進(jìn)展中不同組織之間的串?dāng)_，或各種治療方法和劑量對各種器官的潛在影響。例如，起搏器和心室心肌細(xì)胞的空間分化將極大地增強(qiáng)藥物篩選研究，提供對給定治療的心律和泵功能的見解。纖維母細(xì)胞、免疫細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的摻入也可以進(jìn)一步增強(qiáng)仿生功能。
同樣，許多組織工程研究現(xiàn)在都集中在結(jié)合血管的方法上，以增加營養(yǎng)供應(yīng)和可能的組織厚度。然而，在我們的實驗中納入內(nèi)皮細(xì)胞和其他相關(guān)細(xì)胞類型可能會導(dǎo)致不必要的旁分泌信號，從而影響打印組織中干細(xì)胞的多能性或分化效率[66]。在分化為所需的細(xì)胞類型后，內(nèi)皮細(xì)胞可以被納入像我們這樣的模型中，其中灌注可以進(jìn)一步實現(xiàn)對內(nèi)皮重要的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)[67,68]，并可能誘導(dǎo)血管生成[69]。血管的存在將允許營養(yǎng)輸送的增加，從而進(jìn)一步開發(fā)工程組織的效用。
生物3D打印領(lǐng)域的最新發(fā)展極大地擴(kuò)展了創(chuàng)造復(fù)雜的、與生理相關(guān)的體外組織的潛力。當(dāng)這些組織由人類來源的細(xì)胞形成時，所產(chǎn)生的模型可以提供對疾病機(jī)制、進(jìn)展和治療的增強(qiáng)研究，作為動物模型的補(bǔ)充。在這里，我們利用介質(zhì)灌注和3d生物打印室結(jié)構(gòu)中hipsc的高增殖能力，實現(xiàn)了生成厚組織模型的目標(biāo)�？偟膩碚f，我們預(yù)計，隨著該領(lǐng)域在創(chuàng)造更復(fù)雜組織方面的發(fā)展，特別是與正在開發(fā)的工程策略相結(jié)合，這種在這種模型中擴(kuò)展hipsc的能力將是重要的。在該模型中看到的連續(xù)的hipsc集落的形成將允許各種組織類型的原位分化，以便生成具有更高功能和一致性的組織，從而可靠地進(jìn)行體外建模。
數(shù)據(jù)可用性聲明支持本研究結(jié)果的所有數(shù)據(jù)都包含在文章中(以及任何補(bǔ)充文件)。
致謝我們感謝Jeffrey Ai幫助重新設(shè)計用于灌注的hChaMP結(jié)構(gòu)，Aimee Renaud生成外胚層陽性對照，Victor Garcia獲得hChaMP、生物反應(yīng)器和裝置的圖像，以及明尼蘇達(dá)大學(xué)實驗外科服務(wù)部門幫助測量破裂壓力。我們感謝我們的資金來源，美國國立衛(wèi)生研究院T32GM008347 (ERK)，R01HL137204 (ERK, WL和BMO)和NIBIB/NIH工程復(fù)雜組織中心P41 EB023833，以及美國心臟協(xié)會905669 (ERK)。
參考文獻(xiàn)
[1]Gudapati H, Dey M and Ozbolat I 2016 A comprehensivereview on droplet-based bioprinting: past, present andfuture Biomaterials 102 20–42
[2] Skylar-Scott M A, Uzel S G M, Nam L L, Ahrens J H,Truby R L, Damaraju S and Lewis J A 2019Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellulardensity and embedded vascular channels Sci. Adv. 5 9
[3]Murata D, Arai K and Nakayama K 2020 Scaffold-freebio-3D printing using spheroids as ‘bio-inks’ for tissue(re-)construction and drug response tests Adv. HealthcareMater. 9 1901831
[4] Daly A C, Davidson M D and Burdick J A 2021 3Dbioprinting of high cell-density heterogeneous tissue modelsthrough spheroid fusion within self-healing Nat. Commun.12 1–13
[5] Kupfer M E et al 2020 In situ expansion, differentiation andelectromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3Dbioprinted, chambered organoid Circ. Res. 127 207–24
[6] Ouyang L, Yao R, Mao S, Chen X, Na J and Sun W 2015Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cellsdirects highly uniform embryoid body formationBiofabrication 7 4
[7] Faulkner-Jones A, Fyfe C, Cornelissen D-J, Gardner J, King J,Courtney A and Shu W 2015 Bioprinting of humanpluripotent stem cells and their directed differentiation intohepatocyte-like cells for the generation of mini-livers in 3DBiofabrication 7 4
[8] Ouyang L, Yao R, Zhao Y and Sun W 2016 Effect of bioinkproperties on printability and cell viability for 3Dbioplotting of embryonic stem cells Biofabrication 8 3
[9] Gu Q, Tomaskovic-Crook E, Wallace G G and Crook J M2017 3D bioprinting human induced pluripotent stem cellconstructs for in situ cell proliferation and successivemultilineage differentiation Adv. Healthcare Mater. 6 17
[10] Li Y, Jiang X, Li L, Chen Z-N, Gao G, Yao R and Sun W 20183D printing human induced pluripotent stem cells withnovel hydroxypropyl chitin bioink: scalable expansion anduniform aggregation Biofabrication 10 4
[11] Hamid O A, Eltaher H M, Sottile V and Yang J 2021 3Dbioprinting of a stem cell-laden, multi-material tubularcomposite: an approach for spinal cord repair Mater. Sci.Eng. C 120 111707
[12] Kerscher P, Turnbull I C, Hodge A J, Kim J, Seliktar D,Easley C J, Costa K D and Lipke E A 2016 Direct hydrogelencapsulation of pluripotent stem cells enables ontomimeticdifferentiation and growth of engineered human hearttissues Biomaterials 83 383–95
[13] Gilmozzi V et al 2021 Generation of hiPSC-derivedfunctional dopaminergic neurons in alginate-based 3Dculture Front. Cell Dev. Biol. 9 708389
[14] Gao L et al 2017 Myocardial tissue engineering with cellsderived from human-induced pluripotent stem cells and anative-like, high-resolution, 3-dimensionally printedscaffold Circ. Res. 120 1318–25
[15] Radisic M, Malda J, Epping E, Geng W, Langer R andVunjak-Novakovic G 2006 Oxygen gradients correlate withcell density and cell viability in engineered cardiac tissueBiotechnol. Bioeng. 93 332–43
[16] Ahmed S, Chauhan V M, Ghaemmaghami A M andAylott J W 2018 New generation of bioreactors that advanceextracellular matrix modelling and tissue engineeringBiotechnol. Lett. 41 1–25
[17] Zhang J, Wehrle E, Rubert M and Müller R 2021 3Dbioprinting of human tissues: biofabrication, bioinks, andbioreactors Int. J. Mol. Sci. 22 3971
[18] Adamo L et al 2009 Biomechanical forces promoteembryonic haematopoiesis Nature 459 1131–5
[19] Yamamoto K, Sokabe T, Watabe T, Miyazono K,Yamashita J K, Obi S, Ohura N, Matsushita A, Kamiya A andAndo J 2005 Fluid shear stress induces differentiation ofFlk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelialcells in vitro Am. J. Physiol. Circ. Physiol. 288 H1915–24
[20] Ahsan T and Nerem R M 2010 Fluid shear stress promotesan endothelial-like phenotype during the earlydifferentiation of embryonic stem cells Tissue Eng. A 16 3547
[21] Greuel S, Freyer N, Hanci G, Böhme M, Miki T, Werner J,Schubert F, Sittinger M, Zeilinger K and Mandenius C-F2019 Online measurement of oxygen enables continuousnoninvasive evaluation of human-induced pluripotent stemcell (hiPSC) culture in a perfused 3D hollow-fiber bioreactorJ. Tissue Eng. Regen. Med. 13 1203–16
[22] Fattahi P et al 2021 Core–shell hydrogel microcapsulesenable formation of human pluripotent stem cell spheroidsand their cultivation in a stirred bioreactor Sci. Rep.11 1–13
[23] Isidro I A et al 2021 Online monitoring of hiPSC expansionand hepatic differentiation in 3D culture by dielectricspectroscopy Biotechnol. Bioeng. 118 3610–7
[24] Borys B S et al 2021 Overcoming bioprocess bottlenecks inthe large-scale expansion of high-quality hiPSC aggregates invertical-wheel stirred suspension bioreactors Stem Cell Res.Ther. 12 1–19
[25] Nogueira D E S, Rodrigues C A V, Carvalho M S,Miranda C C, Hashimura Y, Jung S, Lee B and Cabral J M S2019 Strategies for the expansion of human inducedpluripotent stem cells as aggregates in single-useVertical-WheelTM bioreactors J. Biol. Eng. 13 74
[26] Zhu W, Zhao M, Mattapally S, Chen S and Zhang J 2018CCND2 overexpression enhances the regenerative potency ofhuman induced pluripotent stem cell-derivedcardiomyocytes: remuscularization of injured ventricle Circ.Res. 122 88–96
[27] Lee A, Hudson A R, Shiwarski D J, Tashman J W, Hinton T J,Yerneni S, Bliley J M, Campbell P G and Feinberg A W 20193D bioprinting of collagen to rebuild components of thehuman heart Science 365 482–7
[28] Figueroa C A, Vignon-Clementel I E, Jansen K E,Hughes T J R and Taylor C A 2006 A coupled momentummethod for modeling blood flow in three-dimensionaldeformable arteries Comput. Methods Appl. Mech. Eng.195 5685–706
[29] Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S andMadden T L 2012 Primer-BLAST: a tool to designtarget-specific primers for polymerase chain reaction BMCBioinform. 13 134
[30] Kung E O, Les A S, Figueroa C A, Medina F, Arcaute K,Wicker R B, McConnell M V and Taylor C A 2011 In vitrovalidation of finite element analysis of blood flow indeformable models Ann. Biomed. Eng. 39 1947–60
[31] Bonfanti M, Franzetti G, Homer-Vanniasinkam S,Díaz-Zuccarini V and Balabani S 2020 A combined in vivo, invitro, in silico approach for patient-specific haemodynamicstudies of aortic dissection Ann. Biomed. Eng. 48 2950–64
[32] Sargent C Y, Berguig G Y, Kinney M A, Hiatt L A,Carpenedo R L, Berson R E and McDevitt T C 2010Hydrodynamic modulation of embryonic stem celldifferentiation by rotary orbital suspension cultureBiotechnol. Bioeng. 105 611–26
[33] Wang Y, Chou B K, Dowey S, He C, Gerecht S and Cheng L2013 Scalable expansion of human induced pluripotentstem cells in the defined xeno-free E8 medium underadherent and suspension culture conditions Stem Cell Res.11 1103–16
[34] Ismadi M Z, Gupta P, Fouras A, Verma P, Jadhav S, Bellare Jand Hourigan K 2014 Flow characterization of a spinnerflask for induced pluripotent stem cell culture applicationPLoS One 9 e106493
[35] Farzaneh M 2021 Concise review; effects of antibiotics andantimycotics on the biological properties of humanpluripotent and multipotent stem cells Curr. Stem Cell Res.Ther. 16 400–5
[36] Carrier R L, Rupnick M, Langer R, Schoen F J, Freed L E andVunjak-Novakovic G 2002 Perfusion improves tissuearchitecture of engineered cardiac muscle Tissue Eng.8 175–88
[37] Radisic M, Yang L, Boublik J, Cohen R J, Langer R, Freed L Eand Vunjak-Novakovic G 2004 Medium perfusion enablesengineering of compact and contractile cardiac tissue Am. J.Physiol.—Heart Circ. Physiol. 286 507–16
[38] Dahlin R L, Meretoja V V, Ni M, Kasper F K and Mikos A G2012 Design of a high-throughput flow perfusion bioreactorsystem for tissue engineering Tissue Eng. C 18 817–20
[39] Gabetti S et al 2022 An automated 3D-printed perfusionbioreactor combinable with pulsed electromagnetic fieldstimulators for bone tissue investigations Sci. Rep. 12 13859
[40] Yamada S, Yassin M A, Schwarz T, Mustafa K andHansmann J 2022 Optimization and validation of acustom-designed perfusion bioreactor for bone tissueengineering: flow assessment and optimal cultureenvironmental conditions Front. Bioeng. Biotechnol.10 811942
[41] Nsiah B A, Ahsan T, Griffiths S, Cooke M, Nerem R M andMcDevitt T C 2014 Fluid shear stress pre-conditioningpromotes endothelial morphogenesis of embryonic stemcells within embryoid bodies Tissue Eng. A 20 954–65
[42] Blagovic K, Kim L Y and Voldman J 2011 Microfluidicperfusion for regulating diffusible signaling in stem cellsPLoS One 6 8
[43] Nath S C, Day B, Harper L, Yee J, Hsu C Y-M, Larijani L,Rohani L, Duan N, Kallos M S and Rancourt D E 2021 Fluidshear stress promotes embryonic stem cell pluripotency viainterplay between β-catenin and vinculin in bioreactorculture Stem Cells 39 1166–77
[44] Wang Z, Oron E, Nelson B, Razis S and Ivanova N 2012Distinct lineage specification roles for NANOG, OCT4, andSOX2 in human embryonic stem cells Cell Stem Cell10 440–54
[45] Zhang X et al 2009 A role for NANOG in G1 to S transitionin human embryonic stem cells through direct binding ofCDK6 and CDC25A J. Cell Biol. 184 67
[46] Watanabe K et al 2007 A ROCK inhibitor permits survival ofdissociated human embryonic stem cells Nat. Biotechnol.25 681–6
[47] Kim K et al 2020 3,2′ -Dihydroxyflavone improves theproliferation and survival of human pluripotent stem cellsand their differentiation into hematopoietic progenitor cellsJ. Clin. Med. 9 3
[48] Pallardó F V, Markovic J, García J L and Vi˜na J 2009 Role ofnuclear glutathione as a key regulator of cell proliferationMol. Aspects Med. 30 77–85
[49] Ting S, Chen A, Reuveny S and Oh S 2014 An intermittentrocking platform for integrated expansion anddifferentiation of human pluripotent stem cells tocardiomyocytes in suspended microcarrier cultures Stem CellRes. 13 202–13
[50] Correia C et al 2014 Combining hypoxia and bioreactorhydrodynamics boosts induced pluripotent stem celldifferentiation towards cardiomyocytes Stem Cell Rev. Rep.10 786–801
[51] Badenes S M, Fernandes T G, Cordeiro C S M, Boucher S,Kuninger D, Vemuri M C, Diogo M M and Cabral J M S2016 Defined essential 8TM medium and vitronectinefficiently support scalable xeno-free expansion of humaninduced pluripotent stem cells in stirred microcarrier culturesystems PLoS One 11 e0151264
[52] Ackermann M et al 2018 Bioreactor-based mass productionof human iPSC-derived macrophages enablesimmunotherapies against bacterial airway infections Nat.Commun. 9 1–13
[53] Lock L T and Tzanakakis E S 2009 Expansion anddifferentiation of human embryonic stem cells to endodermprogeny in a microcarrier stirred-suspension culture TissueEng. A 15 2051–63
[54] Park Y, Chen Y, Ordovas L and Verfaillie C M 2014 Hepaticdifferentiation of human embryonic stem cells onmicrocarriers J. Biotechnol. 174 39–48
[55] Qiu L, Lim Y M, Chen A K, Reuveny S, Oh S K W, Tan E Kand Zeng L 2016 Microcarrier-expanded neural progenitorcells can survive, differentiate, and innervate host neuronsbetter when transplanted as aggregates Cell Transplant.25 1343–57
[56] Hove J R, Köster R W, Forouhar A S, Acevedo-Bolton G,Fraser S E and Gharib M 2003 Intracardiac fluid forces arean essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesisNature 421 172–7
[57] Courchaine K, Rykiel G and Rugonyi S 2018 Influence ofblood flow on cardiac development Prog. Biophys. Mol. Biol.137 95
[58] Conrad L et al 2021 The biomechanical basis of biasedepithelial tube elongation in lung and kidney developmentDevelopment 148 9
[59] Lorenz L et al 2018 Mechanosensing by β1 integrin inducesangiocrine signals for liver growth and survival Nature562 128–32
[60] Ng W H et al 2022 Recapitulating human cardio-pulmonaryco-development using simultaneous multilineagedifferentiation of pluripotent stem cells eLife 11 e67872
[61] Skylar-Scott M A, Huang J Y, Lu A, Ng A H M, Duenki T,Liu S, Nam L L, Damaraju S, Church G M and Lewis J A2022 Orthogonally induced differentiation of stem cells forthe programmatic patterning of vascularized organoids andbioprinted tissues Nat. Biomed. Eng. 6 449–62
[62] Giacomelli E, Bellin M, Sala L, van Meer B J, Tertoolen L G J,Orlova V V and Mummery C L 2017 Three-dimensionalcardiac microtissues composed of cardiomyocytes andendothelial cells co-differentiated from human pluripotentstem cells Development 144 1008–17
[63] Wu F, Wu D, Ren Y, Huang Y, Feng B, Zhao N, Zhang T,Chen X, Chen S and Xu A 2019 Generation of hepatobiliaryorganoids from human induced pluripotent stem cells J.Hepatol. 70 1145–58
[64] Jin G, Floy M E, Simmons A D, Arthur M M and Palecek S P2021 Spatial stem cell fate engineering via facile morphogenlocalization Adv. Healthcare Mater. 10 2100995
[65] Kilian D, Cometta S, Bernhardt A, Taymour R, Golde J,Ahlfeld T, Emmermacher J, Gelinsky M and Lode A 2022Core-shell bioprinting as a strategy to apply differentiationfactors in a spatially defined manner inside osteochondraltissue substitutes Biofabrication 14 1
[66] Freyer N, Greuel S, Knöspel F, Strahl N, Amini L, Jacobs F,Monshouwer M and Zeilinger K 2017 Effects of co-culturemedia on hepatic differentiation of hiPSC with or withoutHUVEC co-culture Int. J. Mol. Sci. 18 1724
[67] Davies P F 2009 Hemodynamic shear stress and theendothelium in cardiovascular pathophysiology Nat. Clin.Pract. Cardiovasc. Med. 6 16–26
[68] Kinstlinger I S, Calderon G A, Royse M K, Means A K,Grigoryan B and Miller J S 2021 Perfusion andendothelialization of engineered tissues with patternedvascular networks Nat. Protocols 16 3089–113
[69] Galie P A, Nguyen D H T, Choi C K, Cohen D M, Janmey P Aand Chen C S 2014 Fluid shear stress threshold regulatesangiogenic sprouting Proc. Natl Acad. Sci. USA 111 7968–73
- 突破性研究介紹：3D生物打印技術(shù)模擬人類耳蝸下腔
- 超高精度3D光刻材料-光敏樹脂的成分及應(yīng)用領(lǐng)域
- 類器官構(gòu)建的意義及主要構(gòu)建方法的介紹
- 3D細(xì)胞培養(yǎng)相比傳統(tǒng)方法關(guān)鍵優(yōu)勢的詳細(xì)介紹
- BIONOVA X 3D生物打印機(jī)在組織工程中的前沿應(yīng)用及復(fù)雜器官模型構(gòu)建
- 突破組織工程的新技術(shù)之3D打印多血管網(wǎng)絡(luò)和功能構(gòu)建的介紹
- 3D生物打印九月文獻(xiàn)精萃：絲素蛋白在心臟組織生物打印中的應(yīng)用前景等
- LUMEN X生物打印機(jī)助力肝細(xì)胞研究深入探究肝功能藥物代謝等領(lǐng)域
- 網(wǎng)絡(luò)研討會預(yù)告：芯片組織與3D打印構(gòu)建仿生體外模型
- 國內(nèi)首臺商業(yè)化體積打印裝備——OrganSEC成功發(fā)布
- 凈信旗下雷萌生物代表ibidi為壽宇峰博士頒發(fā)論文獎
- 祝賀進(jìn)科馳安獲TissueLabs3D生物打印機(jī)全國總代
- CELLINK開放生物打印BIO ONE應(yīng)用及技術(shù)說明下載通道
- 永沁泉推出全新升級GelMA水凝膠微球促銷活動
- CELLINK推出全新BIO ONE生物打印機(jī)，助力3D細(xì)胞培養(yǎng)
- 2024中西部地區(qū)生物制造及相關(guān)材料發(fā)展論壇通知
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com