內(nèi)毒素的分離提取和純化方法介紹
從20世紀(jì)30年代至今，根據(jù)內(nèi)毒素的理化性質(zhì)而設(shè)計(jì)的分離、鑒定內(nèi)毒素的技術(shù)方法主要有下述幾種：
一、分離提取
（一）三氯醋酸法
Boivin和Messrobeanu于1935年，將活菌或經(jīng)冷凍干燥的大腸桿菌，在4℃條件下與0.25N的三氯醋酸共同振蕩或劇烈攪拌，將細(xì)菌細(xì)胞裂解，使LPS分子從破潰的細(xì)胞外膜上游離出來(lái)。離心后取上清液經(jīng)濃縮后，加2倍體積的冷凍乙醇，將生成的沉淀物溶解、濃縮后冷凍干燥，即得到LPS干粉。此法提取的LPS含有10%左右的菌體蛋白，這些蛋白質(zhì)可影響LPS的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性。
（二）酚-水法
wesphal和luederitz于1952年為分離含蛋白質(zhì)較低的LPS而建立的方法，以后被廣泛應(yīng)用于水溶性S-LPS的提取。具體過(guò)程為：在細(xì)菌的水溶液中，加入等量90%的酚將細(xì)胞裂解，使內(nèi)毒素分子從破潰的細(xì)胞外膜上游離出來(lái)。68℃，振蕩10～15min后，冷卻、離心，收集富含LPS的水相，并反復(fù)用水萃取3～5次，然后將水相濃縮、冷凍于燥，得到粗提的LPS，將粗制品溶解于水，高速離心（100000g，2～3h），得到顆粒狀LPS后再溶于水中冷凍干燥。此法提取的LPS純度較高，蛋白質(zhì)含量為1%~3%。
（三）酚-氯仿-石油醚法
由Galanos設(shè)計(jì)的提取R-LPS的方法。預(yù)先經(jīng)乙醇、丙酮、乙醚脫脂后的干燥菌，用90%苯酚﹑氯仿及石油醚按2∶5∶8所組成的混合提取液提取2～3次，取酚相，得到LPS和孔蛋白（porin）提取液，用減壓法去除溶媒，加水形成沉淀，并洗滌3～5次，然后再用80%苯酚復(fù)溶，減壓干燥，得到的LPS粗制品溶于水，超速離心取沉淀，即得到LPS純品。此法純化得到的LPS，不含核酸和多聚糖，蛋白質(zhì)含量可控制在1%以下。
（四）水-丁醇法
由Morrison等于1975年設(shè)計(jì)。水-丁醇法較酚法簡(jiǎn)便，溫和，適用于提取大腸桿菌和沙門菌的LPS；所得制品含蛋白量約1%。但此方法仍存在一些不足，由于丁醇不能滅活制品中酶類，導(dǎo)致在制備過(guò)程和儲(chǔ)存時(shí)，Lipid A常發(fā)生降解。
二、純化
（一）離子交換層析法
利用陽(yáng)離子樹脂非特異性的吸附帶負(fù)電荷LPS的性質(zhì)，將LPS從流動(dòng)相中分離純化出來(lái)。
（二）親和層析法
利用多粘菌素B特異性結(jié)合LPS的特性，將多粘菌素B包被于聚丙烯胺樹脂等高分子聚合物的表面，制成特異性結(jié)合LPS的層析柱，即可對(duì)LPS進(jìn)行親和層析法純化。
（三）金屬離子和小分子量多胺成分的去除
通常情況下，未提純的LPS溶液中存在大量的小分子帶電物質(zhì)，如Mg2+ 、Ca2+和少量的Fe2+ 、A13+、Zn2+、Na+等離子及乙醇胺、腐胺﹑精胺、亞精胺及尸胺等小分子量多胺。它們中和LPS分子上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，使得本可以用帶電荷的吸附劑將LPS除去的效果明顯降低。電透析便是通過(guò)離子交換的方法進(jìn)行LPS純化的。其原理就是將很多的陰/陽(yáng)離子交換膜交錯(cuò)地串聯(lián)在一起，電解質(zhì)溶液則在膜間流動(dòng)，兩側(cè)施加直流電之后溶液中陽(yáng)離子（如無(wú)機(jī)陽(yáng)離子、生物堿等）向陰極移動(dòng)而陰離子（如無(wú)機(jī)陰離子、有機(jī)酸等）向陽(yáng)極移動(dòng)。其中陰離子可順利通過(guò)陰離子膜，但再往前移動(dòng)時(shí)卻被鄰近的陽(yáng)離子膜擋住。同樣，陽(yáng)離子也可以順利地通過(guò)陽(yáng)離子膜而無(wú)法通過(guò)陰離子膜。中性化合物及高分子化合物則留在透析液中，最終得到純化的提取物（圖2-6）。
一、分離提取
（一）三氯醋酸法
Boivin和Messrobeanu于1935年，將活菌或經(jīng)冷凍干燥的大腸桿菌，在4℃條件下與0.25N的三氯醋酸共同振蕩或劇烈攪拌，將細(xì)菌細(xì)胞裂解，使LPS分子從破潰的細(xì)胞外膜上游離出來(lái)。離心后取上清液經(jīng)濃縮后，加2倍體積的冷凍乙醇，將生成的沉淀物溶解、濃縮后冷凍干燥，即得到LPS干粉。此法提取的LPS含有10%左右的菌體蛋白，這些蛋白質(zhì)可影響LPS的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性。
（二）酚-水法
wesphal和luederitz于1952年為分離含蛋白質(zhì)較低的LPS而建立的方法，以后被廣泛應(yīng)用于水溶性S-LPS的提取。具體過(guò)程為：在細(xì)菌的水溶液中，加入等量90%的酚將細(xì)胞裂解，使內(nèi)毒素分子從破潰的細(xì)胞外膜上游離出來(lái)。68℃，振蕩10～15min后，冷卻、離心，收集富含LPS的水相，并反復(fù)用水萃取3～5次，然后將水相濃縮、冷凍于燥，得到粗提的LPS，將粗制品溶解于水，高速離心（100000g，2～3h），得到顆粒狀LPS后再溶于水中冷凍干燥。此法提取的LPS純度較高，蛋白質(zhì)含量為1%~3%。
（三）酚-氯仿-石油醚法
由Galanos設(shè)計(jì)的提取R-LPS的方法。預(yù)先經(jīng)乙醇、丙酮、乙醚脫脂后的干燥菌，用90%苯酚﹑氯仿及石油醚按2∶5∶8所組成的混合提取液提取2～3次，取酚相，得到LPS和孔蛋白（porin）提取液，用減壓法去除溶媒，加水形成沉淀，并洗滌3～5次，然后再用80%苯酚復(fù)溶，減壓干燥，得到的LPS粗制品溶于水，超速離心取沉淀，即得到LPS純品。此法純化得到的LPS，不含核酸和多聚糖，蛋白質(zhì)含量可控制在1%以下。
（四）水-丁醇法
由Morrison等于1975年設(shè)計(jì)。水-丁醇法較酚法簡(jiǎn)便，溫和，適用于提取大腸桿菌和沙門菌的LPS；所得制品含蛋白量約1%。但此方法仍存在一些不足，由于丁醇不能滅活制品中酶類，導(dǎo)致在制備過(guò)程和儲(chǔ)存時(shí)，Lipid A常發(fā)生降解。
二、純化
（一）離子交換層析法
利用陽(yáng)離子樹脂非特異性的吸附帶負(fù)電荷LPS的性質(zhì)，將LPS從流動(dòng)相中分離純化出來(lái)。
（二）親和層析法
利用多粘菌素B特異性結(jié)合LPS的特性，將多粘菌素B包被于聚丙烯胺樹脂等高分子聚合物的表面，制成特異性結(jié)合LPS的層析柱，即可對(duì)LPS進(jìn)行親和層析法純化。
（三）金屬離子和小分子量多胺成分的去除
通常情況下，未提純的LPS溶液中存在大量的小分子帶電物質(zhì)，如Mg2+ 、Ca2+和少量的Fe2+ 、A13+、Zn2+、Na+等離子及乙醇胺、腐胺﹑精胺、亞精胺及尸胺等小分子量多胺。它們中和LPS分子上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，使得本可以用帶電荷的吸附劑將LPS除去的效果明顯降低。電透析便是通過(guò)離子交換的方法進(jìn)行LPS純化的。其原理就是將很多的陰/陽(yáng)離子交換膜交錯(cuò)地串聯(lián)在一起，電解質(zhì)溶液則在膜間流動(dòng)，兩側(cè)施加直流電之后溶液中陽(yáng)離子（如無(wú)機(jī)陽(yáng)離子、生物堿等）向陰極移動(dòng)而陰離子（如無(wú)機(jī)陰離子、有機(jī)酸等）向陽(yáng)極移動(dòng)。其中陰離子可順利通過(guò)陰離子膜，但再往前移動(dòng)時(shí)卻被鄰近的陽(yáng)離子膜擋住。同樣，陽(yáng)離子也可以順利地通過(guò)陽(yáng)離子膜而無(wú)法通過(guò)陰離子膜。中性化合物及高分子化合物則留在透析液中，最終得到純化的提取物（圖2-6）。
由于提取的LPS中含有較多帶正電荷的雜質(zhì)，因此在LPS的電透析過(guò)程中可發(fā)現(xiàn)陰極的pH值升高，陽(yáng)極的pH值變化不明顯的現(xiàn)象。電透析過(guò)程中LPS溶液的pH值常有一定程度的下降，同時(shí)由于有穩(wěn)定LPS多聚體功能的Mg2+ 、Ca2+等離子成分被除去，LPS多聚體變?yōu)閱误w而發(fā)生沉淀。為避免此現(xiàn)象，需用NaOH或三乙胺將其中和到pH 7.0左右，使其形成中性的、高水溶性的LPS鈉鹽和LPS三乙胺鹽而重新溶解。電透析結(jié)束時(shí)，LPS一般為酸性產(chǎn)物，此酸性LPS在水中的溶解度極低，可直接進(jìn)行凍干處理，-4～-20℃低溫保存，每次使用前可用不同的堿中和轉(zhuǎn)化成所需要的LPS鹽。
（四）核酸成分的去除
根據(jù)LPS與核酸片段在分子量上的差異，可用超速離心法、電泳法等方法將其去除。
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