新測(cè)向流動(dòng)免疫測(cè)定LFA在 Unisart StructSure膜上多重檢測(cè)的案例介紹

圖1: 點(diǎn)陣型LFA的靈活布置點(diǎn)的示意圖。

圖1：基于點(diǎn)的LFA的優(yōu)勢(shì)：由于風(fēng)影效應(yīng)，沿著側(cè)向流動(dòng)方向，每個(gè)點(diǎn)（體積>5納升，紅色圓圈）的強(qiáng)度逐漸減小。B 線性和點(diǎn)狀多重試驗(yàn)的比較（左側(cè)為線性格式，右側(cè)為點(diǎn)狀格式）：沿著側(cè)向流動(dòng)方向，線和點(diǎn)的強(qiáng)度逐漸減小，在一個(gè)通道中依次排列（連續(xù)的點(diǎn)），而一個(gè)通道只有一個(gè)點(diǎn)則保持恒定的強(qiáng)度。C 使用Epson Perfection V600對(duì)B進(jìn)行定量讀取�；叶葟�(qiáng)度描述了在ImageJ中分析的8位圖像的像素值，絕對(duì)值是根據(jù)峰值下面積（AuP）確定的，與背景有所區(qū)別。

Unisart StructSure®膜的優(yōu)勢(shì)
樣品流體的流動(dòng)動(dòng)態(tài)對(duì) LFA 的效果起著至關(guān)重要的作用，影響著分析物和抗體在系統(tǒng)內(nèi)的傳輸和相互作用。Unisart StructSure®膜提供了一種特定的流動(dòng)模式,直接影響LFA的性能。根據(jù)Young-Laplace方程[Olanrewaju等人(2018)]，毛細(xì)力與通道寬度呈反比關(guān)系。作為L(zhǎng)FA的驅(qū)動(dòng)力，較窄的通道會(huì)增加了樣品的流動(dòng)性，需要更少的樣品體積來(lái)達(dá)到相同的流動(dòng)距離。這在處理有限樣品量時(shí)非常有優(yōu)勢(shì)，使該測(cè)定方法更適用于稀缺樣品的應(yīng)用。此外，更大的驅(qū)動(dòng)力導(dǎo)致流速增加，使分析物-檢測(cè)物-混合物更早到達(dá)捕獲抗體。將Unisart StructSure®膜與相同類型的常規(guī)非結(jié)構(gòu)化Unisart膜（CN140）和相同寬度進(jìn)行直接比較，水和血清通過(guò)膜的時(shí)間分別縮短了48%和35%，從而改善了粘性溶液的流動(dòng)性。

此外，如Unisart StructSure®膜所示，將通道寬度從14毫米減小到每個(gè)通道寬度為2毫米的6個(gè)通道，可以促進(jìn)層流流動(dòng)，因?yàn)槔字Z數(shù)（Re）是預(yù)測(cè)流動(dòng)狀態(tài)的參數(shù)，隨著特征長(zhǎng)度（在本例中為通道寬度）的減小而減小，表明雷諾數(shù)較低時(shí)出現(xiàn)層流流動(dòng)。這種流體流動(dòng)的特點(diǎn)是平滑而有序的流體層平行移動(dòng)，提供了更可預(yù)測(cè)和可重現(xiàn)的流動(dòng)曲線，這對(duì)于設(shè)計(jì)精確和可控的實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。層流流動(dòng)減少了分散，使得檢測(cè)成分的相互作用更加局部化和可控化。【Kenis, et al. (2000)】此外，通過(guò)樣品與檢測(cè)試劑的受控混合，能促進(jìn)更有效的相互作用，從而增加靈敏度。為了實(shí)現(xiàn)這種混合，通過(guò)曲線形狀產(chǎn)生湍流，因?yàn)闃悠返牟煌�部分在曲線內(nèi)的通道外部區(qū)域附近承受的壓力會(huì)增加，因此速度變化，導(dǎo)致了分析物的擴(kuò)散（圖）【Krzyk, et al. (2018)】。流體內(nèi)增強(qiáng)的物質(zhì)聚集使得分析物與檢測(cè)器和捕獲抗體接觸，從而改善了結(jié)合。層流流動(dòng)和湍流的受控產(chǎn)生的結(jié)合導(dǎo)致有益的流體動(dòng)力學(xué)，而過(guò)度的分散可能會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

圖2：Unisart StructSure®膜的流體動(dòng)力學(xué)。窄通道在直線段提供層流流動(dòng)，而在彎曲處由于速度變化而產(chǎn)生湍流。內(nèi)壁上的流速比外壁上的流速減小，導(dǎo)致流體重疊和旋渦。
 

波狀結(jié)構(gòu)的另一個(gè)特點(diǎn)是從普通膜的25毫米延伸到Unisart StructSure®膜的26.2毫米的吸收墊距離，為捕獲分子提供更大的距離，從而在分析物和探測(cè)器之間提供更長(zhǎng)的孵育時(shí)間。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，這種延伸可以提供更靈活的實(shí)驗(yàn)布局。

案例研究- 多重膿毒癥快速診斷試紙
Case study
多重膿毒癥是一種危及生命的疾病，當(dāng)機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致全身性炎癥和器官功能障礙。及早準(zhǔn)確的診斷對(duì)于及時(shí)干預(yù)和改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前用于多重膿毒癥診斷的最常用生物標(biāo)志物是降鈣素原（PCT）C反應(yīng)蛋白（CRP），前者通常保持在較低的血液濃度，但在細(xì)菌感染（尤其是多重膿毒癥）時(shí)會(huì)顯著升高，后者則是一般的炎癥標(biāo)志物。由于CRP是一種敏感的標(biāo)志物，但對(duì)于膿毒癥不具有特異性，而PCT是一種特異性較高但敏感性較低的標(biāo)志物，二者的結(jié)合可達(dá)到平衡，改善多重膿毒癥診斷的敏感性和特異性。此外，PCT確保早期發(fā)現(xiàn)膿毒癥，并區(qū)分細(xì)菌性和非細(xì)菌性炎癥，從而提供更準(zhǔn)確和有針對(duì)性的治療決策。測(cè)量PCT和CRP的濃度可以提供關(guān)于膿毒癥嚴(yán)重程度的信息,有助于急性患者的管理和監(jiān)測(cè)。

表1: 用于檢測(cè)膿毒癥的生物標(biāo)志物，以血液濃度作為分界值。
 

借助它們互補(bǔ)的優(yōu)勢(shì)，本白皮書提出的方法用于建立一種多重免疫層析法(multiplex LFA)，將PCT和CRP分別以三個(gè)濃度作為不同嚴(yán)重程度的膿毒癥的分界值(表1)。通過(guò)評(píng)估斑點(diǎn)的存在/不存在以及相應(yīng)的分界值，可以通過(guò)肉眼進(jìn)行半定量評(píng)估，但也可以通過(guò)使用sciREADER LF2 (SCIENION GmbH, 圖9)與集成的動(dòng)力學(xué)測(cè)量算法進(jìn)行定量評(píng)估。

材料與方法
使用SCIENION的sciFLEXARRAYER SX（圖4）精密微量點(diǎn)樣儀,在Unisart CN 140
StructSure®(賽多利斯, 3UN14ER066S01WS）上打印多重陣列。簡(jiǎn)而言之，按照?qǐng)D 5 所示的檢測(cè)布局預(yù)埋10納升三種不同濃度的抗PCT和抗CRP抗體（HyTest）。第二種抗PCT和抗CRP抗體與碳納米顆粒結(jié)合,以?shī)A心測(cè)定的形式檢測(cè)分析物PCT和CRP。

由于配備了兩個(gè)高分辨率攝像頭（圖4，水平攝像頭和垂直攝像頭）,sciFLEXARRAYER系統(tǒng)可以完全控制液滴的生成，從而驗(yàn)證噴點(diǎn)的質(zhì)量。通過(guò)將特定目標(biāo)靶標(biāo)成像為參考點(diǎn)，如同Unisart StructSure®膜（圖3）所示，能夠補(bǔ)償目標(biāo)位置和方向的變化。通過(guò)水平攝像頭監(jiān)測(cè)液滴的生成、液滴體積、質(zhì)量以及與軸定位的偏差，顯示出納米級(jí)的穩(wěn)定液滴（圖 4、5）。在噴點(diǎn)過(guò)程結(jié)束時(shí)，垂直攝像頭可對(duì)目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，只有斑點(diǎn)符合特定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的膜才能通過(guò)檢測(cè)。
 

大卡是通過(guò)使用一張背板（Kenosha牌）、印刷膜、吸收墊（Whatman CF5，Cytiva品牌）以及樣品應(yīng)用墊（玻璃纖維，Kenosha牌）組裝而成的。之后,使用剪切機(jī)（Matrix 2360剪切機(jī)，Kinematic Automation公司）將卡片切割成14毫米寬的條形,確保每個(gè)膜結(jié)構(gòu)的完整性。將膜條放入由Sartorius和SCIENION GmbH 合作開發(fā)的完美貼合的卡殼中，然后涂上結(jié)合物和樣品的混合物,進(jìn)行試運(yùn)行。孵育30分鐘后, 使用帶有集成分析軟件的sciREADER CL2（SCIENION GmbH公司）對(duì)條形進(jìn)行測(cè)量和分析。

sciFLEXARRAYER SX（SCIENION）是一種精密微量點(diǎn)樣儀，用于在Unisart CN 140 StructSure®膜上預(yù)埋抗體。箭頭和數(shù)字表示以下內(nèi)容的存在:（i）壓電式點(diǎn)樣毛細(xì)管；（ii）用于點(diǎn)樣后對(duì)膜成像的垂直相機(jī);（iii）用于可視化和量化滴液參數(shù)的高分辨率水平滴液相機(jī);（iv）膜的靶標(biāo)支架;（v）96孔板的位置，其中包含待點(diǎn)樣的抗體;（vi）控制sciFLEXARRAYER SX微量點(diǎn)樣儀的軟件的計(jì)算機(jī)屏幕。

結(jié)果與討論（提出的解決方案）
結(jié)構(gòu)化膜與精密微量點(diǎn)樣儀技術(shù)相結(jié)合可提高性能

可以通過(guò)眼睛進(jìn)行評(píng)估
在任何類型的膜上都可以在LFA上進(jìn)行基于點(diǎn)的多重檢測(cè)。由于該檢測(cè)的復(fù)雜性，通過(guò)眼睛來(lái)評(píng)估圖案可能具有挑戰(zhàn)性，因此建議使用讀取器進(jìn)行分析。由于Sartorius Unisart StructSure®膜的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可以將視覺(jué)點(diǎn)與相應(yīng)的生物標(biāo)志物相對(duì)應(yīng)，簡(jiǎn)化評(píng)估過(guò)程而無(wú)需讀取器。在已建立的膿毒癥多重檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，即使不是所有的點(diǎn)都出現(xiàn)，也可以很容易區(qū)分膜結(jié)構(gòu)左側(cè)三個(gè)通道中CRP的三個(gè)點(diǎn)和右側(cè)PCT的點(diǎn)（圖5）,從而確保半定量分析和對(duì)感染嚴(yán)重程度和類型（細(xì)菌性、非細(xì)菌性）的決策。小通道可更好地控制檢測(cè)區(qū)域內(nèi)不同的捕獲分子的位置。然而,由于點(diǎn)的大小,決定點(diǎn)存在與否仍然是主觀的,因此使用讀取器是有意義的。這種可指定的定位需要高精度的噴點(diǎn)，而 SCIENION的sciDROP PICO 點(diǎn)樣技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。非接觸式點(diǎn)樣可確保膜的完整性,從而產(chǎn)生具有可控液滴量的均勻斑點(diǎn),實(shí)現(xiàn)最佳的檢測(cè)性能。
 

圖5：Unisart StructSure®膜上的膿毒癥多重檢測(cè)：通過(guò)在截?cái)鄥^(qū)域的相應(yīng)斑點(diǎn)的存在/缺失進(jìn)行半定量評(píng)估。1：鼠IgG，檢測(cè)對(duì)照;2：10 µg/ml CRP的臨界值（低）;3：40 µg/ml CRP的臨界值（中）;4：200 µg/ml CRP的臨界值（高）;5：0.5 ng/ml PCT的臨界值（低）;6：2 ng/ml PCT的臨界值（中）;7：10 ng/ml PCT的臨界值（高）。

信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)
如前所訴,由于反應(yīng)區(qū)域擴(kuò)大，結(jié)構(gòu)化膜提供了有利的流動(dòng)動(dòng)態(tài)，并延長(zhǎng)了分析物與抗體之間的孵育時(shí)間。與同批次的非結(jié)構(gòu)化Unisart® CN140膜相比，結(jié)構(gòu)化膜的信號(hào)強(qiáng)度增加了 52%，這與斑點(diǎn)位置有關(guān)（圖6）。
 

圖6:Unisart StructSure®與非結(jié)構(gòu)化膜的比較。A:非結(jié)構(gòu)膜（左圖）和 Unisart StructSure® 膜（右圖）上 10 納克/毫升 PCT 樣品斑點(diǎn)的半定量評(píng)估。藍(lán)色矩形內(nèi)的斑點(diǎn)用于B：Unisart StructSure®和非結(jié)構(gòu)化膜上0.5、2、10ng/ml PCT斑點(diǎn)強(qiáng)度的比較。

特定的卡殼裝置提高了檢測(cè)的可重復(fù)性并縮短了時(shí)間
專為Unisart StructSure®膜條尺寸設(shè)計(jì)的樣品盒支持流體動(dòng)力學(xué)特性（圖7A）。通過(guò)確保材料之間的均勻過(guò)渡，卡殼裝置保證了所有通道中的控制和均勻流動(dòng)，從而確保更高的重現(xiàn)性。這一點(diǎn)在信號(hào)強(qiáng)度尚未完全形成的孵育時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)得尤為明顯，使用卡殼裝置而非松散的檢測(cè)棒孵育30分鐘后，膿毒癥多重LFA的CV值減少了10%（圖7 B）。因此，這種用于日常實(shí)驗(yàn)室或家庭使用的即時(shí)檢測(cè)可以在較短的時(shí)間內(nèi)完成，而無(wú)需等待信號(hào)完全形成（此處為60分鐘）。
 

圖7：使用LFA盒改善流體動(dòng)力學(xué)。（A）14毫米Unisart StructSure®和常規(guī)Unisart® LFA試劑盒的圖片，由Scienion GmbH和賽多利斯公司合作設(shè)計(jì)和制作。（B）與無(wú)卡殼情況下，30分鐘和60分鐘孵育后控制點(diǎn)信號(hào)變異系數(shù)（CV）的比較。每個(gè)變種測(cè)試了包括6個(gè)控制點(diǎn)的16個(gè)試紙條。

同時(shí)檢測(cè)豐度差異極大的分析物
除了已知的Sartorius Unisart®膜的質(zhì)量外，Unisart StructSure®膜的特性還允許在一根膜條上同時(shí)檢測(cè)濃度相差4-5個(gè)數(shù)量的豐度差異很大的分析物。當(dāng)將具有大量豐度差異的生物標(biāo)志物結(jié)合在所需測(cè)量范圍內(nèi)時(shí)，提高一個(gè)生物標(biāo)志物的靈敏度同時(shí)降低另一個(gè)生物標(biāo)志物的靈敏度可能具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)檢測(cè)成分（如樣品緩沖液、樣品體積、樣品稀釋、固相材料和流體動(dòng)力學(xué)）直接影響兩種檢測(cè)方法。通過(guò)添加與過(guò)量CRP分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的非標(biāo)記抗CRP抗體，可以顯著降低CRP實(shí)驗(yàn)的靈敏度，而不會(huì)影響PCT檢測(cè)所需的靈敏度。通過(guò)改變各自的捕獲抗體濃度，可以區(qū)分ng/ml范圍內(nèi)的PCT濃度，同時(shí)檢測(cè)ng/ml濃度的CRP（圖8）。
 

圖8：調(diào)整捕獲抗體濃度以達(dá)到所需的靈敏度

A：在不同的CRP分析物濃度下，根據(jù)CRP捕獲抗體濃度和PCT分析物濃度的變化曲線，在臨界點(diǎn)的低、中、高三個(gè)位置進(jìn)行滴度測(cè)定。

B：在不同的捕獲抗體值下，可以區(qū)分CRP和PCT的臨界點(diǎn)。

圖 9：用于LFA檢測(cè)定量讀數(shù)的sciREADER LF2

使用Unisart StructSure®膜可以對(duì)CRP和PCT臨界值進(jìn)行半定量評(píng)估，但使用SCIENION 的掃描儀技術(shù)可以更容易地區(qū)分臨界值上是否存在斑點(diǎn)。sciREADER LF2是一種便攜式掃描儀設(shè)備，專為 LFA 的動(dòng)力學(xué)和終點(diǎn)分析而設(shè)計(jì)，尤其適用于分析由多個(gè)檢測(cè)器區(qū)域組成的斑點(diǎn)陣列，其強(qiáng)大的網(wǎng)格排列和斑點(diǎn)查找算法確保了分析的準(zhǔn)確性。用于檢測(cè)高表達(dá)血液標(biāo)志物（如CRP）的夾心免疫測(cè)定通常受到鉤狀效應(yīng)的限制。通過(guò)實(shí)時(shí)測(cè)量測(cè)試點(diǎn)和對(duì)照點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度，可觀察到測(cè)試與對(duì)照比率（T/C）的變化，表明低濃度和極高濃度分析物的信號(hào)發(fā)展速度不同，而終點(diǎn)測(cè)量時(shí)的最終 T/C 值可能相同[Rey等（2017）]。這使得通過(guò)動(dòng)力學(xué)測(cè)量來(lái)擴(kuò)展LFA的動(dòng)態(tài)范圍成為可能。

此外,動(dòng)力學(xué)還能在早期階段識(shí)別反應(yīng),一旦檢測(cè)到臨界值，可以立即停止測(cè)量,從而減少測(cè)定時(shí)間。由于信號(hào)強(qiáng)度的發(fā)展速率與夾心式或競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中的分析物濃度成正比或反比，因此可以使用不同測(cè)量點(diǎn)之間的斜率并參照預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測(cè)定，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以在讀取程序中定義為參考。這樣,每次測(cè)試時(shí)就無(wú)需攜帶單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)即可進(jìn)行定量測(cè)定。

每通道檢測(cè)一個(gè)結(jié)合物，提高特異性
在全貼試劑盒中，結(jié)合物通常被分散并干燥到適合樣品溶解的墊上。在多重檢測(cè)法中，有多種方法可以將檢測(cè)抗體整合到一起，例如同時(shí)結(jié)合、單獨(dú)結(jié)合抗體的混合，同時(shí)將所有檢測(cè)器固定在釋放墊上，或者將單個(gè)結(jié)合物在墊上進(jìn)行空間分離。無(wú)論如何，在運(yùn)行過(guò)程中，樣品-結(jié)合物混合物一起流過(guò)膜時(shí)，檢測(cè)抗體會(huì)混合在一起，從而存在交叉污染和非特異性的風(fēng)險(xiǎn)。Unisart StructSure®膜的細(xì)分現(xiàn)在提供了全面分離相應(yīng)檢測(cè)物的新可能性，避免了非關(guān)鍵反應(yīng)抗體之間的接觸，從而提高了特異性。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將結(jié)合物直接應(yīng)用到經(jīng)過(guò)預(yù)封閉的結(jié)構(gòu)化膜的一個(gè)通道中時(shí)，可以獲得有希望的結(jié)果，以避免膜與結(jié)合物之間的結(jié)合。此外，分隔的通道可在某些通道中放置疏水性障礙，以實(shí)現(xiàn)不同的反應(yīng)時(shí)間，以支持相應(yīng)生物標(biāo)記物-抗體動(dòng)力學(xué)，并滿足檢測(cè)不同濃度范圍的生物標(biāo)記物的要求。目前正在研究結(jié)合物從膜上溶解的能力和相關(guān)的檢測(cè)功能，以及通過(guò)對(duì)膜進(jìn)行疏水性處理來(lái)改進(jìn)對(duì)不同豐度生物標(biāo)記物的同時(shí)檢測(cè)。

致謝
作者衷心感謝未來(lái)診斷公司作為合作伙伴，在研發(fā)案例研究檢測(cè)方面進(jìn)行發(fā)明、創(chuàng)造和驗(yàn)證體外診斷產(chǎn)品的合作。