DNA提取方法的有效性和回收率比較：手動(dòng)均質(zhì)化與Spex Genomax®

有效地均質(zhì)化生物組織和破壞細(xì)胞的能力對(duì)于產(chǎn)生足夠質(zhì)量和數(shù)量的DNA和RNA研究所需的核酸至關(guān)重要。此外，由于其整體異質(zhì)性或?qū)嶒?yàn)室接收到的狀態(tài)，許多樣品需要均質(zhì)化或減小顆粒大小以創(chuàng)建代表性樣品。均勻性是指在整個(gè)樣品中具有一致組成狀態(tài)，而異質(zhì)性則在一個(gè)或多個(gè)特征上缺乏一致性。

實(shí)驗(yàn)室或分析樣品必須經(jīng)過(guò)處理，以便進(jìn)行提取、加工或消化以進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。在生物樣品中，均質(zhì)化可以通過(guò)破壞生物組織和溶解細(xì)胞來(lái)加速處理速度，從而允許提取遺傳物質(zhì)。獲得均勻樣品的最常見(jiàn)方法是研磨或粉碎，這可以提高準(zhǔn)確性并減少不確定性。在實(shí)驗(yàn)室中，一些科學(xué)家使用手動(dòng)或半自動(dòng)的方法進(jìn)行組織處理，這可能會(huì)耗費(fèi)時(shí)間并且產(chǎn)生的樣品可能沒(méi)有完荃均質(zhì)化。實(shí)施自動(dòng)化的均質(zhì)化和處理可以提高樣品的處理量，同時(shí)從生物材料中更快地恢復(fù)DNA/RNA。

這項(xiàng)研究將證明使用自動(dòng)化均質(zhì)化方法在節(jié)省時(shí)間方面的效率，以及對(duì)遺傳物質(zhì)的回收和提取的改進(jìn)。在之前使用Spex Geno/Grinder^®的研究中，發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)和環(huán)境產(chǎn)品的農(nóng)藥提取大大增強(qiáng)了回收率，同時(shí)顯著縮短了樣品制備的處理時(shí)間。

在這項(xiàng)新的研究中（由Spex和HoppeSyler共同進(jìn)行的聯(lián)合項(xiàng)目），使用手動(dòng)小球攪拌器和自動(dòng)化均質(zhì)器（Spex Genomax）來(lái)破壞各種生物組織，然后在進(jìn)行基因組DNA（gDNA）分離之前。分離的gDNA隨后用于下游敏感的應(yīng)用中，以確定手動(dòng)與自動(dòng)均質(zhì)器在分析學(xué)和分子生物學(xué)研究中的有效性。

1 方法和材料

該工作流程主要涉及三個(gè)過(guò)程：1. 組織均質(zhì)化；2. DNA提�。�3. DNA分離。

組織均質(zhì)化

將60毫克的新鮮組織加入500微升的DNA結(jié)合緩沖液和20微升的蛋白酶K（20 mg/mL），這些試劑來(lái)自Spex DNAmax動(dòng)物基因組DNA分離試劑盒。根據(jù)制造商的協(xié)議進(jìn)行組織的均質(zhì)化和處理。然后將樣品在55ºC下以700 rpm的速度輕輕搖動(dòng)15分鐘進(jìn)行孵育。在蛋白酶K消化后，向裂解物中加入20微升的RNase A，并在室溫下孵育五分鐘，然后加入200微升的>95%乙醇。然后通過(guò)渦旋器將裂解物劇烈混合五秒鐘。

DNA提取和柱清洗

渦旋后，將700µL裂解物加載到DNAmax試劑盒提供的硅膠旋轉(zhuǎn)柱上，并在室溫下以13,000 xg離心一分鐘。丟棄流過(guò)液，并將500µL來(lái)自試劑盒的洗滌緩沖液A（添加了乙醇）添加到柱中，再次離心三分鐘。丟棄所得的流過(guò)液。

DNA分離和洗脫

將柱子離心額外一分鐘，并丟棄收集管。向柱子中加入100 µL的EB或TE緩沖液（pH 8.0），并在室溫下靜置三分鐘，然后再次離心一分鐘。收集含有純化的gDNA的流過(guò)液進(jìn)行分析和qPCR。

手動(dòng) VS Genomax：核酸分離和回收

在比較手動(dòng)和自動(dòng)研磨的第一次研究中，各種動(dòng)物組織（牛里脊肉、雞胸肉和小鼠心臟）的樣品經(jīng)過(guò)均質(zhì)化、提取和分離gDNA的處理。使用手動(dòng)均質(zhì)化的樣品平均處理時(shí)間超過(guò)200分鐘（接近2個(gè)半小時(shí)），而使用Spex Genomax的時(shí)間不到1/2小時(shí)（圖1）。使用自動(dòng)化的Genomax方法，處理時(shí)間減少了超過(guò)86%。

圖1. 使用手動(dòng)和Genomax處理gDNA均質(zhì)化、提取和分離的處理時(shí)間
 

比較了三種動(dòng)物組織（牛里脊肉、雞胸肉和小鼠心臟）中提取的遺傳物質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量。牛里脊肉和雞胸肉代表了不同密度的動(dòng)物肌肉組織。小鼠心臟代表了難以均質(zhì)化的纖維狀動(dòng)物器官組織。傳統(tǒng)上，高密度和纖維狀組織最難均質(zhì)化，并且產(chǎn)生的可回收gDNA量最少。使用手動(dòng)方法和Genomax處理后，分離gDNA并使用紫外/可見(jiàn)光譜法測(cè)試濃度（圖2）。

圖2. 使用手動(dòng)和Genomax方法在不同動(dòng)物組織中回收DNA

手動(dòng)方法通常會(huì)導(dǎo)致DNA提取和分離不完整，而使用Genomax進(jìn)行自動(dòng)化均質(zhì)化手動(dòng)方法通常會(huì)導(dǎo)致DNA提取和分離不完整，而使用Genomax進(jìn)行自動(dòng)化均質(zhì)化可以實(shí)現(xiàn)完荃的均質(zhì)化和高效的提取，如圖3中的電泳凝膠所示。

圖3. 使用手動(dòng)和Genomax自動(dòng)化均質(zhì)化處理的DNA的凝膠電泳

在這項(xiàng)首次研究的一項(xiàng)后續(xù)研究中，使用商用手動(dòng)小球混合器和Spex Genomax均質(zhì)器對(duì)30毫克的小鼠心臟進(jìn)行均質(zhì)化。根據(jù)制造商的建議，使用手動(dòng)均質(zhì)器對(duì)小鼠心臟進(jìn)行均質(zhì)化，而Genomax中的組織則經(jīng)過(guò)三輪均質(zhì)化處理，每輪以1500 rpm的速度均質(zhì)化1分鐘，每輪之間有20秒的暫停。使用Spex DNAmax試劑盒分離DNA，并使用涵蓋小鼠Ostβ啟動(dòng)子或Hic1基因體的引物制備用于qPCR分析的樣品。每個(gè)分析都進(jìn)行了雙重檢測(cè)。與手動(dòng)均質(zhì)化相比，發(fā)現(xiàn)Genomax的產(chǎn)量增加了35倍。實(shí)際上，在使用0.25 µL至1 µL的分離gDNA時(shí)，Genomax樣品產(chǎn)生了強(qiáng)烈的曲線(xiàn)，而使用手動(dòng)均質(zhì)器分離的gDNA生成了1 µL的擴(kuò)增曲線(xiàn)（圖4）。

圖4. 小鼠有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)β啟動(dòng)子的復(fù)制。9號(hào)染色體，65330248-65330323(75個(gè)堿基對(duì)) ，使用Genomax和手動(dòng)處理

使用較小體積的gDNA（0.25 µL和0.5 µL）時(shí)，目標(biāo)基因的擴(kuò)增在使用Genomax時(shí)被證明是成功的，而通過(guò)手動(dòng)處理分離的gDNA未能產(chǎn)生任何信號(hào)（圖5）。

圖5. 低樣品體積下，使用手動(dòng)方法和Genomax復(fù)制小鼠高甲基化癌癥1基因體的結(jié)果對(duì)比。染色體11，75058091-75058200（109個(gè)堿基對(duì)）

2 結(jié)論

自動(dòng)化的均質(zhì)化和細(xì)胞裂解過(guò)程提高了處理的效率，無(wú)論是在時(shí)間上還是在最終的gDNA提取上。使用Genomax等自動(dòng)化過(guò)程，目標(biāo)gDNA的質(zhì)量和數(shù)量以及復(fù)制性都顯著提高，特別是與Spex DNAmax提取試劑盒結(jié)合使用時(shí)。總體而言，使用Genomax處理樣本的時(shí)間大大減少到不到半小時(shí)，并且在較低的樣品體積下產(chǎn)生更多可復(fù)制的遺傳物質(zhì)副本。