測序技術(shù)在缺鐵對后代大腦發(fā)育及行為研究的應(yīng)用
缺鐵（ID）是世界上普遍的營養(yǎng)缺乏癥。鐵被認為是包括神經(jīng)發(fā)育在內(nèi)的許多生物過程的必需元素。在懷孕期間，發(fā)育中的大腦特別容易受到環(huán)境損害，這可能會不可逆轉(zhuǎn)地損害關(guān)鍵的發(fā)育過程。雖然成年期慢性智力障礙導(dǎo)致的許多功能障礙可以通過補充鐵劑來逆轉(zhuǎn)，但胎兒時期的智力障礙對大腦結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生持續(xù)影響。
在幾個大腦區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了胎兒缺鐵導(dǎo)致的改變，大量證據(jù)發(fā)現(xiàn)海馬體的脆弱性，海馬體是一個在圍產(chǎn)期具有高代謝需求和廣泛發(fā)育的區(qū)域。海馬體在學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮著重要作用，其病理改變與兒童早期智力缺陷后的認知缺陷密切相關(guān)。
在這里，我們設(shè)計了一個小鼠模型來檢驗這樣一種假設(shè)，即妊娠期和哺乳期早期母體飲食供應(yīng)保持缺鐵性飲食，導(dǎo)致的胎兒和新生兒缺鐵與成年后代抑郁和焦慮樣行為有關(guān)。我們在模型中全面描述了缺鐵的行為后果，從產(chǎn)后早期對母親行為和小鼠超聲波發(fā)聲的評估，到成年后代的抑郁和焦慮樣行為。通過定義其在成年海馬體中的miRNA特征，揭示了早期生命缺鐵對大腦分子組成的長期影響。
研究方法
本研究采用了飲食鐵限制的小鼠模型，其中母鼠在整個懷孕期間和哺乳早期接受缺鐵飲食 (IDD)，圖 1 A。在此背景下，我們決定使用48ppm的飲食作為邊際IDD，使用96ppm的飲食作為鐵充足飲食 (ISD)對照，這樣可以評估妊娠缺鐵的長期后果，而不會出現(xiàn)胎兒生長遲緩或母體貧血的非特異性偏差。這相當(dāng)于孕婦每日膳食攝入13.5毫克鐵（比每天 27 毫克減少50%）。
圖1
產(chǎn)婦護理行為
在PD1和PD6之間，每天上午11點至下午1點和下午3點至5點使用攝像頭記錄，每 3分鐘對行為進行一次視頻評分，包括對幼鼠舔/梳理、筑巢、護理和非幼鼠相關(guān)參數(shù)（進食/睡眠、自我梳理）的評估。展示個人行為所花費的時間被描述為總行為活動的百分比（%）。
超聲波發(fā)聲
在PD4上，從每窩中隨機選擇4只幼崽來評估超聲波發(fā)聲 (USV) 叫聲。為此，將幼鼠單獨放置在一個裝有USB超聲波麥克風(fēng)的隔音箱中3分鐘。使用諾達思的聲音行為分析系統(tǒng)(UltraVox XT)對獲得的聲譜圖進行分析，以計算呼叫的數(shù)量和幅度。
聲音行為分析系統(tǒng)(UltraVox XT)可以通過捕獲完整的聲譜，處理和分析嚙齒動物的超聲波聲和其它動物的聲音。您可以在頻譜圖中直觀地選擇叫聲，并根據(jù)頻率、幅度、持續(xù)時間和時間間隔對類似的叫聲進行分類。您也可以將聲音數(shù)據(jù)輕松導(dǎo)出到動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)和行為觀察記錄分析系統(tǒng)(The Observer XT)中，與其它行為數(shù)據(jù)結(jié)合分析。
更多測試
本研究還會進行蔗糖偏好測試、曠場測試、明暗箱試驗、旋轉(zhuǎn)測試、強迫游泳測試、尾部懸掛測試、血液分析等測定，以及酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、大腦分析（普魯士藍染色、NeuN染色）、神經(jīng)發(fā)生分析和miRNA測序。對于許多測試中動物運動軌跡的追蹤可以使用動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)來輕松實現(xiàn)。
動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)是應(yīng)用于跟蹤和分析任何動物的行為、運動和活動研究中最廣泛的視頻跟蹤軟件。在研究魚類或昆蟲時，還可以結(jié)合兩個攝像機角度對實驗對象進行跟蹤，并結(jié)合三維軌跡跟蹤系統(tǒng)中的三維跟蹤項目實現(xiàn)三維追蹤。
結(jié)果
缺鐵不會改變幼鼠出生前或出生后的生長，但會降低腦鐵含量
我們首先確認，接受 IDD（48ppm FeSO4；n=38）和 ISD（96ppm FeSO4；n=43）的母親在懷孕期間體重增加沒有差異。此外，IDD 對每窩幼仔數(shù)量（圖 1，C）、每窩活幼仔百分比（圖 1，D）或其出生體重（圖 1，E））沒有影響 ，證實 IDD 不會導(dǎo)致宮內(nèi)生長遲緩/死亡或胎兒死亡。為了防止由于出生后大量生長期間鐵需求大幅增加而造成的生長偏差，所有動物在PD10時均轉(zhuǎn)為 ISD。
在 PD11 對IDD和ISD后代的腦海馬切片測定非血紅素鐵（n = 6）。普魯士藍染色顯示 IDD 幼崽海馬體中鐵含量顯著降低（圖 2（A，B））。使用神經(jīng)元標(biāo)記NeuN進行的免疫組織化學(xué)顯示，IDD和ISD后代的神經(jīng)元密度具有可比性（圖 2，C），表明邊緣胎兒ID不會導(dǎo)致神經(jīng)元丟失或阻礙神經(jīng)發(fā)生。
圖2
另外，成年IDD和ISD動物的海馬鐵含量沒有差異（圖2（D，E）），證實幼年期鐵儲備的補充足以使腦鐵含量達到成年期的控制水平。
產(chǎn)后護理行為
本研究通過產(chǎn)后前六天的觀察評估了IDD和ISD母鼠的自發(fā)孕產(chǎn)婦護理行為 (n=6)，發(fā)現(xiàn) IDD母親舔舐和梳理幼崽的相對時間有選擇性和具體的減少，但沒有其他幼崽指導(dǎo)（護理和筑巢）或非幼崽指導(dǎo)的（自我梳理、睡眠、飲食）行為表現(xiàn)（圖3（A，B））。
母性關(guān)懷行為是一種基于母親與子女互動的社會行為形式。幼崽與母親的交流是通過幼崽超聲波發(fā)聲來進行的。然而，我們發(fā)現(xiàn) IDD 幼崽的超聲波發(fā)聲沒有改變，IDD幼崽和ISD幼崽發(fā)出的超聲波叫聲的數(shù)量及其幅度相當(dāng)（圖 3（C-E）），這表明在這個發(fā)育階段，幼崽不太可能出現(xiàn)溝通障礙，并且IDD幼崽能夠有效地與母親互動。
圖3
生命早期的缺鐵持續(xù)擾亂情感行為
本研究測試了具有胎兒/新生兒ID史的成年雌性和雄性動物（P90-P120；n=20-28），并在一組高度特定的行為范式標(biāo)準(zhǔn)中測試了對照組：蔗糖偏好測試、強迫游泳測試、懸尾測試、明暗箱、曠場測試。在所有測試中，一致發(fā)現(xiàn)胎兒/新生兒ID后動物的抑郁和焦慮樣行為有所增加。這反映在強迫游泳和懸尾測試中的行為絕望（不動）顯著增加（圖 4（A，B）），以及明暗箱中焦慮樣行為增加（在明處中花費的時間減少）（圖 4，C））。在蔗糖偏好測試中，對蔗糖的偏好沒有顯著差異（圖4，D）。未發(fā)現(xiàn)成年IDD后代在開闊場地測試中的一般探索行為和旋轉(zhuǎn)棒的運動活動發(fā)生變化（圖4（E，F(xiàn)）），排除了不具體的表現(xiàn)偏差，并證實了專門評估情感行為的測試結(jié)果的相關(guān)性。
圖4
缺鐵后成人海馬祖細胞增殖保持完整
在各種實驗?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)以及人體研究中，有大量證據(jù)支持成人海馬神經(jīng)發(fā)生在抑郁癥和抗抑郁治療反應(yīng)中的作用。因此，我們開始使用5-Bromo-2 Deoxyuridine（BrdU）標(biāo)記齒狀回中新生成的細胞來評估海馬祖細胞的增殖，來測試海馬神經(jīng)發(fā)生的紊亂是否與胎兒/新生兒ID后小鼠的行為缺陷有關(guān)（圖5，A）。我們發(fā)現(xiàn)IDD和ISD動物之間的新生細胞數(shù)量沒有差異（圖5（B，C）），并進一步證實NeuN免疫組織化學(xué)顯示的神經(jīng)元總數(shù)在各組之間具有可比性（圖5，D）。
圖5
獨特的miRNA表達反映了早期生命缺鐵對大腦的長期影響
miRNA是基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并參與多種精神疾病的病理生理學(xué)。重要的是，鐵在 miRNA通路的活性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在此背景下，我們決定在胎兒 ID 后對成年動物的海馬組織進行無偏miRNA測序。
經(jīng)過多次測試的統(tǒng)計校正后，我們確定了IDD和ISD成年后代之間表達顯著差異的530個 miRNA。與對照組相比，在有早年ID史的動物海馬組織中，其中284個miRNA上調(diào)，246 個miRNA下調(diào)（圖 6，A）。
僅考慮那些 log2 倍變化≥ +1.5 或≤−1.5 的miRNA，揭示了早期生命ID對同一家族的兩個miRNA（miR 200a和miR 200b）的選擇性和特異性影響，這兩個 miRNA 均位于小鼠 4 號染色體上。靶基因預(yù)測揭示了miRNA 200a和miRNA 200b的253個共享靶基因（圖 6，B）。對預(yù)測的共享目標(biāo)的生物功能（圖6，C）的進一步生物信息學(xué)分析顯示，有大量顯著富集的基因集。
圖6
討論
在這項研究中，即使在懷孕和哺乳期間，鐵的供應(yīng)量略有減少，也足以使胎兒大腦發(fā)育偏向于對心理健康，特別是抑郁癥的不利后果。盡管大腦發(fā)育的主要部分發(fā)生在妊娠末期，但本研究設(shè)計在整個妊娠期限制了飲食中的鐵攝入量，以更接近于人類的情況。所提供的數(shù)據(jù)顯示，懷孕期間飲食鐵攝入量僅減少50%，就會降低幼年后代大腦的鐵含量，并對成年后代的情感行為產(chǎn)生長期影響，這是由抑郁和焦慮樣行為增加的表型特征定義的，但對鐵儲存和血清鐵指數(shù)沒有持續(xù)影響。
IDD母鼠的舔舐/理毛行為水平低于對照組，妊娠ID損害了自發(fā)的產(chǎn)婦護理行為。母親的照顧行為對后代的發(fā)育很重要，具體而言，母親的舔舐/梳理行為是新生嚙齒動物觸覺刺激的主要來源，可調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、情緒和對壓力的認知反應(yīng)的發(fā)展，因此會增加患情感障礙（包括抑郁癥）的風(fēng)險和焦慮癥。不能排除IDD后代的行為表型至少部分是由于產(chǎn)后早期接受的護理行為減少的結(jié)果。
本研究結(jié)果揭示了成年IDD后代海馬組織中兩種 miRNA（miR 200a 和 miR 200b）的特異性和選擇性失調(diào)�？紤]到大量證據(jù)支持miRNA在大腦發(fā)育中的重要作用，以及關(guān)于miRNA在控制行為和情緒中的功能的新興文獻，特別是在這種調(diào)節(jié)受損的精神疾病中，這一觀察結(jié)果是相關(guān)的。miR 200a和miR 200b及其靶基因可能構(gòu)成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)形成了早期生命ID對情感行為影響的病理生理事件的分子基礎(chǔ)。
結(jié)論
總的來說，在懷孕和哺乳期間接受缺鐵性食物的母親所孕育的幼崽腦鐵含量降低，母親有明顯較少的舔舐和梳理行為。有胎兒和新生兒缺鐵病史的成年后代表現(xiàn)出抑郁和焦慮樣行為的增加，同時海馬中的miRNA表達譜紊亂，特別是miR200a和miR200b的水平。胎兒期和新生兒期的缺鐵對小鼠的情感行為具有終身影響，并在大腦中的miRNA表達上留下了特定而持久的印記。胎兒和新生兒缺鐵需要進一步被視為日后發(fā)展為抑郁癥和焦慮癥的風(fēng)險因素。
參考文獻
Gundacker, Anna, et al. "Early-life iron deficiency persistently disrupts affective behaviour in mice." Annals of Medicine 55.1 (2023): 1265-1277.
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