脂質(zhì)納米顆粒的發(fā)展和在藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用

脂質(zhì)納米顆粒作為 COVID-19 mRNA 疫苗的重要組成部分，在有效保護(hù) mRNA 和將 mRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。裸的 DNA 或 RNA 在體液中容易被核酸酶迅速降解，難以在靶組織中積累。且免疫系統(tǒng)也能夠識(shí)別并降解外源性的核酸引發(fā)免疫反應(yīng)[1]。

基于 DNA 或 RNA 的基因療法遇到的最大問(wèn)題便是藥物遞送。為了實(shí)現(xiàn)安全有效的核酸遞送，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了脂質(zhì)納米顆粒（Lipid nanoparticle, LNP）以保護(hù)核酸不被降解，最大限度地向靶細(xì)胞遞送，并減少核酸對(duì)脫靶細(xì)胞的暴露。

“脂質(zhì)體”一詞出現(xiàn)于上世紀(jì)六十年代，當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)封閉的脂質(zhì)雙層囊泡能在水中自發(fā)形成。
脂質(zhì)體是一種納米載體，由一個(gè)或幾個(gè)脂質(zhì)雙層組成，大小在 20 nM 到  1000 nM 之間，親水性藥物可以封閉在脂質(zhì)體的水性?xún)?nèi)部區(qū)域，而疏水性藥物可以包裹在脂雙層的烴鏈區(qū)域中[1]。因此，脂質(zhì)體被廣泛研究用于藥物輸送。

脂質(zhì)體能夠穩(wěn)定用于治療的化合物并克服細(xì)胞和組織吸收的障礙[2][3]，改善化合物對(duì)疾病部位的靶向性，從而減少在非靶器官中的積累[4]。根據(jù)給藥途徑和疾病部位，結(jié)合不同遞送平臺(tái)的脂質(zhì)體可以進(jìn)一步改善封裝化合物的遞送。

圖 1. 不同類(lèi)型脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)的示意圖^[4]。

 (A) 傳統(tǒng)脂質(zhì)體；(B) 聚乙二醇化脂質(zhì)體；(C) 配體靶向脂質(zhì)體；(D) 治療診斷脂質(zhì)體。

 

脂質(zhì)納米顆粒是由一個(gè) (單層) 或多個(gè) (多層) 磷脂雙層組成的球形囊泡，通常由四種成分組成：陽(yáng)離子脂質(zhì) (Cationic lipids)、輔助脂質(zhì) (Helper lipids)、膽固醇  (Cholesterol) 和聚乙二醇化脂質(zhì) (Pegylated lipids, PEG-lipids) (圖 2)。

 

圖 2. 含有 mRNA 的脂質(zhì)納米顆粒的示意圖^[1]。

 

▐  陽(yáng)離子脂質(zhì)

最早的脂質(zhì)納米顆粒使用的是陽(yáng)離子脂質(zhì)，其容易與帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合。但是這種基于陽(yáng)離子脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)在體內(nèi)和體外都具有毒性和免疫原性。例如 DOTAP 和 DOTMA 可以被帶負(fù)電荷的血清蛋白中和，導(dǎo)致毒性和功效降低[1]。

作為一種替代方案，可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)（Ionizable cationic lipids）被開(kāi)發(fā)出來(lái)，它減少了陽(yáng)離子脂質(zhì)納米顆粒引起的毒性，同時(shí)保留了有效的轉(zhuǎn)染特性。可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)（如 DLin-KC2-DMA 和 D-Lin-MC3-DMA）的可電離叔胺部分在酸性 pH 值下帶凈正電荷，但在血液循環(huán)系統(tǒng)中 (pH 7.4) 保持中性[5]。這種 pH 敏感性有利于核酸藥物在體內(nèi)的傳遞，因?yàn)楸３种行缘闹�質(zhì)納米顆粒與血細(xì)胞陰離子膜的相互作用較少，從而提高了脂質(zhì)納米顆粒的生物相容性。
一般情況下，細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用攝取脂質(zhì)納米顆粒。當(dāng)脂質(zhì)納米顆粒進(jìn)入 pH 值較低的內(nèi)涵體中，可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)被質(zhì)子化變得帶正電荷，這促進(jìn)內(nèi)涵體膜的不穩(wěn)定，使膜破裂，脂質(zhì)納米顆粒發(fā)生內(nèi)涵體逃逸[6]。目前，有五種主要的可電離脂質(zhì)類(lèi)型廣泛用于 RNA 遞送[7]。

 

圖 3. 可電離脂質(zhì)和五種主要結(jié)構(gòu)類(lèi)別的可電離脂質(zhì)破壞內(nèi)體的機(jī)制^[7]。

陰離子內(nèi)體磷脂和質(zhì)子化的可電離脂質(zhì)形成的錐形離子對(duì)可以破壞雙層結(jié)構(gòu)，促進(jìn)內(nèi)體逃逸。根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性，RNA 遞送的可電離脂質(zhì)可分為不飽和（含有不飽和鍵）、多尾（含有兩個(gè)以上尾）、聚合（含有聚合物或樹(shù)枝狀聚合物）、可生物降解（含有可生物降解鍵）和尾部支鏈脂質(zhì)（包含分支尾部）。

▐  聚乙二醇化脂質(zhì)

聚乙二醇化脂質(zhì)是另一種重要的脂質(zhì)納米顆粒成分，聚乙二醇脂質(zhì)（如 DMG-PEG 2000 和 DSPE-MPEG-2000）是由親水性聚乙二醇通過(guò)磷酸鹽、甘油或其他連接物與疏水性烷基鏈結(jié)合而成。 聚乙二醇化脂質(zhì)位于脂質(zhì)納米顆粒的表面，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域深埋在顆粒中，聚乙二醇結(jié)構(gòu)域從表面伸出。

聚乙二醇化脂質(zhì)可以延長(zhǎng)脂質(zhì)體的循環(huán)時(shí)間，因?yàn)榫垡叶�醇形成了一個(gè)空間屏障，防止血漿蛋白的結(jié)合，否則會(huì)導(dǎo)致它們被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞快速清除[8]。

此外，聚乙二醇化脂質(zhì)還可以控制納米顆粒的大小。這是因?yàn)樵谥圃爝^(guò)程中低 pH 和乙醇環(huán)境將促進(jìn)脂質(zhì)納米顆粒聚集融合，而聚乙二醇化脂質(zhì)的位阻屏障防止了這種情況的發(fā)生，并有助于產(chǎn)生具有窄多分散性和小粒徑的均勻顆粒群 (通常為50–100 nM)[8][9]。完全缺少聚乙二醇脂質(zhì)的配方會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定的、多分散的脂質(zhì)納米顆粒[9]。

圖 4. 聚乙二醇脂質(zhì)含量對(duì)脂質(zhì)納米顆粒形態(tài)和大小的影響^[10]。

 

▐  膽固醇

膽固醇具有疏水性和剛性，可填充脂質(zhì)體膜內(nèi)脂質(zhì)之間的空隙，促進(jìn)囊泡的穩(wěn)定性。膽固醇衍生物的分子幾何結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步影響脂質(zhì)納米顆粒的遞送效果和生物分布。輔助脂質(zhì)多為磷脂（phospholipids)，如 DSPC 和 DOPE，通過(guò)促進(jìn)與細(xì)胞和內(nèi)體膜的融合，促進(jìn)細(xì)胞攝取和內(nèi)涵體釋放。

 

已知超過(guò) 40% 治療癌癥的小分子藥物在水中溶解度低，而脂質(zhì)體作為藥物遞送系統(tǒng)能夠封裝這些藥物并提高其水溶性，降低了藥物對(duì)正常組織的毒性，延長(zhǎng)了藥物的停留時(shí)間。許多脂質(zhì)納米顆粒藥物制劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于許多臨床試驗(yàn)，作為抗癌、抗炎、抗生素、抗真菌、麻醉劑和其他藥物和基因療法的遞送系統(tǒng)，尤其是在遞送核酸藥物領(lǐng)域。

例如，最早獲批的脂質(zhì)體藥物 Doxil，一種抗腫瘤藥物阿霉素的脂質(zhì)納米粒制劑，使用納米顆粒延長(zhǎng)在人血漿中的循環(huán)時(shí)間，同時(shí)降低阿霉素的心臟毒性[11]。

其次，核酸藥物 Patisiran，一種在脂質(zhì)納米顆粒負(fù)載的 siRNA 藥物，可減少肝臟中轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的形成，最近獲得 FDA 批準(zhǔn)用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性。它是最早獲批脂質(zhì)納米顆粒制劑核酸藥物，被視作核酸療法發(fā)展的重要里程碑。

此外，脂質(zhì)納米顆粒最新的成功應(yīng)用是 Pfizer/BioNTech 和 Moderna 獲批上市的兩種 COVID-19 mRNA 疫苗的遞送載體。兩種 mRNA 疫苗的脂質(zhì)納米顆粒的組成非常相似（圖 5A）。

圖 5. COVID-19 mRNA 疫苗脂質(zhì)納米顆粒^[11]。

A：COVID-19 mRNA 疫苗脂質(zhì)納米顆粒的脂質(zhì)成；B：COVID-19 mRNA 疫苗脂質(zhì)納米顆粒的脂質(zhì)成分的結(jié)構(gòu)。

 

不過(guò)，未經(jīng)修飾的脂質(zhì)納米顆粒同樣具有局限性。脂質(zhì)納米顆粒會(huì)在肝臟積聚，缺乏肝臟以外器官靶向選擇性。

一篇題為"Lung-selective mRNA delivery of synthetic lipid nanoparticles for the treatment of pulmonary lymphangioleiomyomatosis" 的文章中，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)文庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn) N 系列脂質(zhì)（尾部含有酰胺鍵）制備的納米顆粒能夠選擇性地將 Cre mRNA 遞送到小鼠肺中，而且只要調(diào)整 N 系列脂質(zhì)的頭部結(jié)構(gòu)就可以實(shí)現(xiàn)靶向不同的肺細(xì)胞類(lèi)型（圖 4）。

在 306-N16B LNP 中，33.6% 的肺內(nèi)皮細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，1.5% 的上皮細(xì)胞和 1.9%  的巨噬細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。而 113-N16B LNP 優(yōu)先將 Cre mRNA 傳遞給內(nèi)皮細(xì)胞（占內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)的 69.6%），但也傳遞給巨噬細(xì)胞 (18.9%) 和上皮細(xì)胞 (7.3%) 。這一研究有助于解決脂質(zhì)納米顆粒向肝臟以外器官（如肺和腎）的有效遞送的問(wèn)題。

圖 6. 通過(guò)調(diào)整脂質(zhì)的頭部結(jié)構(gòu)的頭部結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)納米顆�？梢园邢虿煌�類(lèi)型的肺細(xì)胞^[12]。

(A) 將 Cre mRNA 傳遞到 tdTomato 轉(zhuǎn)基因 Ai14 小鼠腹部的示意圖。(B, C) IVIS 成像系統(tǒng)拍攝的 Ai14 小鼠不同器官中 tdTomato 熒光的圖像，共聚焦顯微鏡拍攝的肺組織的免疫熒光圖像，以及通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì) 306-N16B (B) 和 113-N16B (C) LNPs 定量分析 tdTomato 陽(yáng)性細(xì)胞在肺部特定細(xì)胞類(lèi)型中的百分比。

脂質(zhì)納米顆粒能夠?qū)⒉煌�藥物（mRNA、siRNA和小分子藥物等）包封并可控地輸送到體內(nèi)的特定部位，這使得它們對(duì)治療多種疾病非常有用。隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展相信脂質(zhì)納米顆粒會(huì)幫助更多藥物實(shí)現(xiàn)高效遞送。
 

DOTAP 一種陽(yáng)離子脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

DOTMA 一種陽(yáng)離子脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

DLin-KC2-DMA 一種陽(yáng)離子脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

D-Lin-MC3-DMA 一種陽(yáng)離子脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

ALC-0315 一種陽(yáng)離子脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

ALC-0159 一種陽(yáng)離子脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

SM-102 一種陽(yáng)離子脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

306-N16B 一種陽(yáng)離子脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

113-N16B 一種陽(yáng)離子脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

DMG-PEG2000 一種聚乙二醇化脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成 。

DSPE-MPEG2000 一種聚乙二醇化脂質(zhì)，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

DSPC 一種磷脂，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

DOPE 一種磷脂，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成。

Cholesterol 膽固醇，可用于脂質(zhì)納米顆粒的合成 。

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