QCM生物傳感器助力評估懸浮細(xì)胞表面糖基化情況研究

導(dǎo)讀：描述了一種基于凝集素的懸浮細(xì)胞生物傳感器，可利用QCM技術(shù)無標(biāo)記檢測腫瘤細(xì)胞表面糖基與蛋白相互作用的結(jié)合動力學(xué)。與傳統(tǒng)的生物傳感器相比，這種細(xì)胞生物傳感器能夠?qū)崟r、無標(biāo)記地原位檢測懸浮腫瘤細(xì)胞表面的糖基化情況，獲得更加接近于生物環(huán)境下的相互作用信息。

借用白同學(xué)的短視頻話語：“今天是三甲子，三甲子帶來新的生命起始”。作為生命科學(xué)儀器的供應(yīng)商，三十年時間內(nèi)看到了很多方法學(xué)帶來的商業(yè)起伏，QCM是屬于不溫不火的一類方法學(xué)，原因可能是應(yīng)用領(lǐng)域的研究開發(fā)以及推廣使用的不足，我們希望將三甲子的運氣帶給QCM。
我們在2023年末選擇了十年前的這篇文獻(xiàn)，作為2024年的開篇，致敬裴志超教授團(tuán)隊！也感謝第一作者李學(xué)明博士對本文做了認(rèn)真的修改和校正！
2013年裴志超團(tuán)隊發(fā)表在《Chemical Communications》中題為“A suspension-cell biosensor for real-time determination of binding kinetics of protein-carbohydrate interactions on cancer cell surfaces”的研究論文，首次提出了一種懸浮細(xì)胞QCM生物傳感器，并將其應(yīng)用于評估懸浮細(xì)胞表面糖基化情況及其與蛋白的結(jié)合動力學(xué)研究。

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/CC/c3cc45006f

1. QCM懸浮細(xì)胞芯片的制備

研究人員首先將LNB-羧基芯片插入Attana細(xì)胞生物傳感器中。芯片表面的羧基經(jīng)EDC-sulfo-NHS活化，然后通過氨基偶聯(lián)的方法將凝集素Con A共價結(jié)合到芯片表面，芯片上未反應(yīng)完全的活化羧基用乙醇胺封閉（圖1中的步驟i、ii）。然后，通過凝集素Con A與細(xì)胞表面糖基的相互作用將懸浮細(xì)胞（人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞K562和人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat）捕獲到芯片表面（圖1中的步驟iii）制得QCM懸浮細(xì)胞芯片。將不同種類或濃度的凝集素溶液進(jìn)樣到QCM懸浮細(xì)胞芯片表面，凝集素與細(xì)胞表面糖基的相互作用（結(jié)合或解理）通過QCM生物傳感器實時檢測，獲得豐富的相互作用信息（圖1中的步驟iv）。    

 
為了評估懸浮細(xì)胞在芯片表面的捕獲情況，可以使用Hoechst染料對細(xì)胞核進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。如圖2所示，懸浮細(xì)胞已被成功地捕獲到了芯片上，且細(xì)胞分布均勻。
 

圖2 熒光顯微鏡下觀察芯片表面的細(xì)胞捕獲情況

2. 細(xì)胞表面糖基化情況研究

凝集素作為一種能夠高度特異性識別并結(jié)合特定結(jié)構(gòu)糖基的蛋白，已成為研究腫瘤細(xì)胞表面糖基化的一個重要工具。如麥胚凝集素（WGA）、伴刀豆球蛋白A（Con A）、大豆凝集素（SBA）、荊豆凝集素I（UEA-I）和花生凝集素（PNA）能夠分別特異性識別并結(jié)合細(xì)胞表面的N-乙�；�葡糖胺、甘露糖/葡萄糖、N-乙酰基半乳糖胺、L-巖藻糖和半乳糖殘基。通過檢測腫瘤細(xì)胞與這一系列凝集素的相互作用可以對腫瘤細(xì)胞表面的糖基化情況進(jìn)行評估。

研究人員分別將兩種不同類型的懸浮細(xì)胞（人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞K562和人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat）捕獲到芯片表面，制得QCM懸浮細(xì)胞芯片，并對這兩種細(xì)胞表面的糖基化情況進(jìn)行了研究。如圖3所示，WGA對Jurkat細(xì)胞具有較高的響應(yīng)值（123 Hz）說明Jurkat細(xì)胞表面具有高表達(dá)量的N-乙酰基葡糖胺，而K562細(xì)胞表面具有較低水平的N-乙酰基葡糖胺（48 Hz）。Con A和SBA對Jurkat細(xì)胞的響應(yīng)值分別為：29 Hz和15 Hz，對K562細(xì)胞的響應(yīng)值分別為24 Hz和10 Hz，兩者相差不大，說明兩種細(xì)胞表面葡萄糖/甘露糖和N-乙�；�半乳糖胺表達(dá)量較接近。UEA-I對K562細(xì)胞的響應(yīng)值為12 Hz，而對Jurkat細(xì)胞的響應(yīng)值只有2.8 Hz，說明K562細(xì)胞表面較Jurkat細(xì)胞表面具有較高水平的L-巖藻糖表達(dá)。PNA對兩種細(xì)胞的響應(yīng)值均很弱說明兩種細(xì)胞表面的只有微量的半乳糖表達(dá)。由此可見，不同的凝集素對不同的細(xì)胞的響應(yīng)值差異表明了細(xì)胞表面的糖基化差異情況。    

 

3. 分子與細(xì)胞相互作用動力學(xué)研究

基于QCM技術(shù)的細(xì)胞生物芯片能夠直接在細(xì)胞表面檢測分子與細(xì)胞的相互作用，并能夠獲得相互作用的動力學(xué)數(shù)據(jù)。

如圖4所示，研究人員通過檢測一系列濃度的凝集素SBA與K562細(xì)胞的相互作用（檢測凝集素與細(xì)胞的結(jié)合過程105 s、解離過程295 s）。結(jié)合－解離曲線用Attana分析軟件進(jìn)行擬合分析，獲得SBA與K562細(xì)胞相互作用的動力學(xué)數(shù)據(jù)：結(jié)合速率常數(shù)k_on = 7.56 × 10⁴ M^-1 s^-1、解離速率常數(shù)k_off = 3.89 × 10^-4 s^-1，以及親和常數(shù)K_D = 5.15 nM。（圖中黑色曲線為實際所測SBA與K562細(xì)胞相互作用曲線，紅色曲線為軟件擬合曲線）    

 

圖4 SBA與K562細(xì)胞相互作用的動力學(xué)研究

結(jié) 論

研究人員提出了一種新穎的基于QCM技術(shù)的無標(biāo)記懸浮細(xì)胞生物芯片，用于實時檢測凝集素與細(xì)胞表面糖基的相互作用。將凝集素Con A共價修飾到QCM芯片表面，通過懸浮細(xì)胞表面的糖鏈與芯片表面Con A的特異性相互作用將懸浮細(xì)胞固定到芯片表面，制備QCM懸浮細(xì)胞生物芯片，并對這兩種懸浮腫瘤細(xì)胞表面糖基化情況及其與凝集素相互作用的動力學(xué)進(jìn)行了研究。該研究所制備的懸浮細(xì)胞生物芯片可實時、無標(biāo)記檢測懸浮細(xì)胞表面的生物分子與蛋白的相互作用，并進(jìn)行相互作用的動力學(xué)研究，為研究懸浮細(xì)胞表面的糖基化情況提供了一種方便簡潔、快速高效的新方法，為深刻理解和研究細(xì)胞表面的分子識別過程提供了一種新研究手段。

參考資料：

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/CC/c3cc45006f

Attana分子與細(xì)胞相互作用檢測儀是基于石英晶體微天平（QCM）技術(shù)原理，可實時、無標(biāo)記的檢測分子相互作用的系統(tǒng)。目前已在動力學(xué)反應(yīng)、抗原抗體反應(yīng)、競爭力分析、有效濃度檢測、抗原表位定位、粗樣篩選、候選藥物的篩查等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

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