表面等離子體共振(SPR)顯微鏡在Chemerin與CCRL2受體結(jié)合研究中的應(yīng)用

化學(xué)引誘受體及其同源配體是破壞腫瘤進(jìn)展級聯(lián)反應(yīng)的有前途的藥物靶點。大多數(shù)化學(xué)引誘受體是傳統(tǒng)的七次跨膜（7TM）G偶聯(lián)蛋白受體（GPCRs）^1,2。ACKRs（非典型趨化因子受體）與傳統(tǒng)的GPCR不同，它不激活引導(dǎo)細(xì)胞遷移所需的依賴于 G 蛋白的信號傳導(dǎo)^3,4。相反，它們通過充當(dāng)清道夫受體、促進(jìn)趨化因子內(nèi)吞作用或產(chǎn)生趨化因子梯度來調(diào)節(jié)趨化因子的可用性。

C-C基序趨化因子受體樣2(CCRL2)是一種與 ACKR 家族相關(guān)的非信號轉(zhuǎn)導(dǎo)7TM 受體⁵。然而，CCRL2與ACKRs不同，因為它缺乏配體清除功能，也缺乏與經(jīng)典趨化因子結(jié)合確認(rèn)的能力。CCRL2 是一種非信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，它能與趨化配體結(jié)合，使白細(xì)胞被招募到炎癥部位。然而，人們對直接與 CCRL2 結(jié)合的配體類型和功能影響還缺乏了解。

最近在表面等離子體共振領(lǐng)域技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)了在自然表達(dá)條件下配體-受體相互作用的表征。表面等離子體共振（SPR）顯微鏡結(jié)合了SPR和明場顯微鏡（圖1A）來檢測未標(biāo)記分子與細(xì)胞表面目標(biāo)的結(jié)合。^6-8
 

圖 1 (A)SPRM 儀器的示意圖，描繪了 SPR 和明場輸入、細(xì)胞室和樣品流。⁹（B） Chemerin 與跨膜 CCRL2 受體結(jié)合。

SPRM 測量整個細(xì)胞表面分子相互作用的動力學(xué)，對于確定配體與細(xì)胞表面表達(dá)受體的結(jié)合速率（ka）、解離速率（kd）和結(jié)合親和力（KD）至關(guān)重要。利用BI的ImageSPR™ 分析軟件，SPRM 傳感器表面被均勻地劃分為數(shù)百個興趣區(qū)域（ROI）。

在本研究中，使用BI SPRm200儀器證實，在親代 HEK 293T 細(xì)胞和變異型 HEK-huCCRL2 細(xì)胞上⁹，一種非趨化因子趨化蛋白--Chemerin與CCRL2 結(jié)合（圖 1B）。當(dāng)Chemerin暴露于HEK-huCCRL2 細(xì)胞時，在細(xì)胞上觀察到大量的ROI（圖 2A），但當(dāng)Chemerin暴露于親代HEK細(xì)胞時，只有少量的ROI出現(xiàn)（圖 2B），這表明Chemerin能特異性地結(jié)合表達(dá)CCRL2 的細(xì)胞。采用 1:1 結(jié)合模型評估Chemerin與表達(dá) HEK-huCCRL2 細(xì)胞結(jié)合的動力學(xué)數(shù)據(jù)，顯示計算的結(jié)合速率、解離速率和結(jié)合親和力（圖 2C、D 和 E）直方圖趨于穩(wěn)健高斯分布，其中檢測到Chemerin在親代HEK細(xì)胞中的結(jié)合率極低，KD 值無法計算。本研究報告了實驗中Chemerin與HEK-huCCRL2細(xì)胞結(jié)合的平均值，包括結(jié)合速率（ka = 3.11E+05 M-1 s -1 ）、解離速率（kd = 1.16E-03 s -1 ）和結(jié)合親和力（KD = 5.49 nM）。重要的是，通過 SPRM 測定的Chemerin與 huCCRL2 結(jié)合的平均 KD 與之前報道的通過放射性標(biāo)記的Chemerin與過表達(dá) huCCRL210 的細(xì)胞結(jié)合而測定的結(jié)合親和力（2.35 nM）相當(dāng)¹⁰。
 

表 1 Chemerin與 HEK-huCCRL2 的結(jié)合概況

通過 SPRM，可以對一種以前未報道過的 C-C 趨化因子進(jìn)行直接結(jié)合和動力學(xué)分析。研究人員測定了 Chemerin 與 HEK 293T 親本細(xì)胞以及 HEKhuCCRL2 變體細(xì)胞上的 CCRL2 的結(jié)合動力學(xué)。

CCRL2 不激活細(xì)胞內(nèi)的 G 蛋白，而是將配體集中在質(zhì)膜上¹¹ 。該受體的下游信號傳導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，因此鑒定能中和 CCRL2 與配體結(jié)合的工具是研究其功能的主要途徑。為此，我們使用 SPRM 作為一種確證抗體結(jié)合的方法，研究兩種抗 huCCRL2 單克隆抗體（K097F7 和 152254）與 HEK-huCCRL2 細(xì)胞和親代 HEK 293T 細(xì)胞的結(jié)合動力學(xué)。在 HEK-huCCRL2 細(xì)胞上檢測到了大量的 ROI（圖 3A 和 3B），但在親代 HEK 細(xì)胞上沒有檢測到。
 

表 2 與 HEK-huCCRL2 結(jié)合的中和抗體概況

K097F7 和 152254 與 HEK-huCCRL2 細(xì)胞的結(jié)合親和力（KD）分別為 2.48 nM 和 4.75 nM（表 2），重要的是，K097F7 和 152254 與親代 HEK 細(xì)胞的最小結(jié)合導(dǎo)致 KD 值無法計算。此外，觀察到同型對照抗體與 HEK-huCCRL2 細(xì)胞的結(jié)合極少（圖 3C），這表明 K097F7 和 152254 與 CCRL2 是特異性結(jié)合。
 

SPRm200系統(tǒng)將光學(xué)顯微鏡與分子互作技術(shù)相結(jié)合，專為觀察和測量細(xì)胞膜表面蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合親和力及動力學(xué)常數(shù)設(shè)計，為分子相互作用的研究開辟了新的方法。
(1)SPRm200系統(tǒng)無需對觀察目標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，可以實時定量的進(jìn)行檢測；
(2)可同時可視化觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和局部結(jié)合活性；
(3)無需提取細(xì)胞膜蛋白，即可在正常活細(xì)胞狀態(tài)下觀察和測量藥物和膜蛋白的實時相互作用；
(4)探測器測量每個像素點的SPR響應(yīng)，并將其映射到SPR圖像中，在每個像素處，記錄一個傳感圖，從而提供更多的局部信息。

SPRM技術(shù)使在自然條件下研究細(xì)胞表面膜蛋白與其他目標(biāo)分子結(jié)合和相互作用成為可能。SPRm200細(xì)胞原位分子互作動態(tài)分析系統(tǒng)憑借其卓越的靈敏度和穩(wěn)定性，助力科學(xué)研究新發(fā)現(xiàn)，推動藥物開發(fā)新高度。

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