應(yīng)用DAP-seq技術(shù)鑒定BcERF070下游靶基因揭示小白菜開花的分子機(jī)制

不結(jié)球白菜（Pak-choi），俗稱小白菜，是一種原產(chǎn)于中國的多葉狀蔬菜，已逐漸在世界范圍內(nèi)種植。小白菜易于早熟的特性，限制了生長發(fā)育和產(chǎn)量積累。因此，了解小白菜的開花調(diào)控機(jī)制對育種和產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

2024年1月25日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的研究成果發(fā)表在Plant Physiology期刊上（影響因子7.4），題目為“ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing BcLEAFY expression”。該研究使用DNA親和純化測序（DAP-seq）技術(shù)鑒定了小白菜中BcERF070的下游靶基因，揭示了BcERF070響應(yīng)乙烯抑制小白菜開花的潛在分子機(jī)制。
 

在外源乙烯處理?xiàng)l件下，小白菜開花延遲，蓮座葉數(shù)量增加，BcERF070的表達(dá)增加，并在處理2 h時(shí)達(dá)到峰值。此外，BcERF070的轉(zhuǎn)錄水平在整個(gè)營養(yǎng)生長期逐漸下降，并在生殖期達(dá)到最低。因此BcERF070參與了乙烯介導(dǎo)的開花調(diào)控。BcERF070基因沉默后，促進(jìn)小白菜提早開花，蓮座葉數(shù)量降低，BcFT誘導(dǎo)表達(dá)。因此，BcERF070在小白菜開花過程中起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用。乙烯處理的沉默植株開花時(shí)間明顯提前，但晚于未處理組。由此表明BcERF070并不是參與小白菜開花調(diào)控的唯一途徑。
 

采用Y2H實(shí)驗(yàn)篩選到了BcERF070的互作蛋白BcMLP328，隨后使用BiFC、LCI、GST pull down、Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)果。然而，BcERF070和BcMLP328相互作用調(diào)控開花的機(jī)制尚不清楚。
 

乙烯處理小白菜促使BcMLP328的表達(dá)量降低。此外，BcMLP328僅在花器官中高表達(dá)。這表明BcMLP328可能與開花過程有關(guān)。隨后在小白菜中構(gòu)建了BcMLP328的過表達(dá)株系和沉默株系，通過表型觀察分析和開花相關(guān)基因（BcSOC1、BcSPL15、BcFT、BcAP3、BcTEM）表達(dá)量檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BcMLP328促進(jìn)小白菜開花。然而，BcMLP328促進(jìn)開花的機(jī)制尚不清楚。
 

采用Y2H實(shí)驗(yàn)篩選到了BcMLP328的互作蛋白BcbHLH30，隨后使用LCI、BiFC、Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了BcMLP328和BcbHLH30在體內(nèi)和體外的互作。隨后在小白菜中構(gòu)建BcbHLH30沉默株系，發(fā)現(xiàn)在沉默株系中開花延遲、蓮座葉增多、開花調(diào)控基因（BcFT和BcLFY）表達(dá)量降低。這些結(jié)果表明，BcbHLH30正調(diào)控小白菜開花過程。
 

采用Y1H實(shí)驗(yàn)篩選BcbHLH30下游靶基因，發(fā)現(xiàn)BcbHLH30直接結(jié)合花相關(guān)基因BcLFY的啟動子，激活其表達(dá)。LUC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論。隨后，ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測到在過表達(dá)BcbHLH30的小白菜株系中含有CATTTG-box的P2片段被顯著富集，EMSA實(shí)驗(yàn)證明了BcbHLH30與BcLFY啟動子區(qū)的CATTTG-box結(jié)合。共轉(zhuǎn)化煙草葉片實(shí)驗(yàn)表明BcMLP328增強(qiáng)了BcbHLH30對BcLFY的激活能力。
 

為了驗(yàn)證BcERF070對于BcMLP328與BcbHLH30互作的影響，使用LCI實(shí)驗(yàn)證明，BcMLP328和BcbHLH30共轉(zhuǎn)染組中熒光明顯增強(qiáng)，然而在加入BcERF070之后，熒光強(qiáng)度顯著降低。EMSA實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)論。因此，BcERF070對BcMLP328與BcbHLH30的相互作用產(chǎn)生負(fù)向影響，這可能會降低BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對BcLFY的轉(zhuǎn)錄激活。

推測BcERF070是通過破壞BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物進(jìn)而延遲開花，那么BcMLP328沉默株系、BcERF070和BcMLP328雙沉默株系的開花時(shí)間理應(yīng)相似。但出乎意料的是，BcERF070和BcMLP328雙沉默株系的開花時(shí)間早于BcMLP328沉默株系，蓮座葉也較少。由此推測BcERF070也可能通過破壞BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物以外的途徑來影響開花。
 

采用DAP-seq分析可視化觀察到在Bcc29的啟動子區(qū)域存在較強(qiáng)的BcERF070結(jié)合峰，以及在BcBBX29的啟動子上可能存在結(jié)合區(qū)域。Y1H、Dual-LUC報(bào)告實(shí)驗(yàn)、EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了BcERF070與BcBBX29啟動子結(jié)合并激活其表達(dá)。與對照株系相比，BcBBX29沉默株系的開花時(shí)間更早、蓮座葉更少、BcFT表達(dá)更強(qiáng)。在過表達(dá)BcBBX29的擬南芥中觀察到開花時(shí)間更晚、蓮座葉更多。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BcERF070通過直接激活BcBBX29的轉(zhuǎn)錄來延緩開花。
 

圖8. 小白菜中BcERF070調(diào)控晚開花的分子機(jī)制模型。

在沒有乙烯的情況下，BcERF070的表達(dá)量較低，導(dǎo)致開花提前。然而，在乙烯存在的情況下，BcERF070的表達(dá)被誘導(dǎo)，增加的BcERF070通過直接互作破壞BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對BcLFY的激活，導(dǎo)致開花延遲；另外BcERF070還通過直接促進(jìn)開花抑制子BcBBX29的表達(dá)來抑制BcFT的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)晚開花。
 
小結(jié)：該研究提出了BcERF070響應(yīng)乙烯調(diào)控小白菜開花的分子機(jī)制。外源乙烯處理增加了BcERF070的表達(dá)，延緩了開花。BcERF070通過削弱小白菜中BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對BcLFY的激活來延遲開花，此外BcERF070還直接促進(jìn)開花抑制子BcBBX29的表達(dá)，從而降低BcFT的表達(dá)，進(jìn)而延緩開花。本研究為乙烯介導(dǎo)的小白菜晚開花提供了見解，并為應(yīng)用乙烯調(diào)控作物生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
 
文獻(xiàn)來源：Zhanghong Yu, Xiaoshan Chen, Yan Li, Sayyed Hamad Ahmad Shah, Dong Xiao, Jianjun Wang, Xilin Hou, Tongkun Liu, Ying Li. ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing BcLEAFY expression, Plant Physiology, 2024, kiae021, 
https://doi.org/10.1093/plphys/kiae021