在NIR-II激發(fā)下用于膠質(zhì)瘤靶向成像的NIR-II光聲/NIR-IIa熒光探針

本文要點(diǎn)：相較于近紅外一區(qū)（NIR-I, 650-900 nm），近紅外二區(qū)（NIR-II, 1000-1700 nm）窗口的光聲（Photoacoustic, PA）和熒光雙模態(tài)成像具有最大允許曝光高、自身熒光低和穿透深度大等優(yōu)點(diǎn)而獲得了廣泛的關(guān)注。然而，由于缺乏合適的材料，在NIR-II激發(fā)下主動(dòng)靶向膠質(zhì)瘤的NIR-II PA/NIR-IIa（1300-1400nm）熒光成像卻少有報(bào)道。

本研究制備了一種靶向αvβ3的NIR-II光聲/NIR-IIa小分子熒光探針I(yè)R-32p，并使用U87MG荷瘤小鼠評(píng)價(jià)其成像效果。在1020/1064 nm激發(fā)下，在原位膠質(zhì)瘤模型中表現(xiàn)出良好的腫瘤攝取、高靶向特異性等特殊的雙模成像特性，顯示出可穿透顱骨獲得優(yōu)異的成像結(jié)果。本研究同時(shí)還證實(shí)了在體內(nèi)NIR-II PA/FL成像中，NIR-II激發(fā)優(yōu)于NIR-I。

 

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將αvβ3整合素結(jié)合肽環(huán)cRGDfK與N3-PEG16-COOH的羧基端偶聯(lián)，生成N3-PEG16-cRGDfK，所得的加合物N3-PEG16-cRGDfK通過(guò)銅催化的疊氮化物-炔環(huán)加成的鍵合反應(yīng)與5H5偶聯(lián)，就得到了化合物IR-32p。

IR-32p因與PEG連接而具有良好的水溶性，能在水溶液中自組裝形成穩(wěn)定有序、尺寸分布均勻（d=10.0±3.0 nm）的球形膠束。IR-32p在水中的最大吸收波長(zhǎng)為1094 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為1120 nm。同時(shí)在水中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的NIR-I和NIR-II PA信號(hào)，且信號(hào)強(qiáng)度隨濃度的增加具有良好的線性關(guān)系，在800-890 nm處的強(qiáng)度比在1000-1100 nm處的強(qiáng)度高約30%。在不同培養(yǎng)基中幾乎保持了一致的熒光/PA強(qiáng)度，并顯示出優(yōu)異的穩(wěn)定性，這有利于體內(nèi)外的長(zhǎng)期跟蹤。

圖1. IR-32p的合成路徑、水中的光學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性

 

由于IR-32p在NIR-I和NIR-II激發(fā)下均有強(qiáng)烈PA信號(hào)，作者進(jìn)而比較了在NIR-I和NIR-II激發(fā)下，IR-32p成像的生物組織穿透深度。盡管隨著成像深度增加，兩種激發(fā)的PA成像信號(hào)背景比（SBR）均顯著降低。但相同條件下，NIR-II PA成像（1020nm激發(fā)）始終顯示出比NIR-I（800nm激發(fā)）更高的SBR。IR-32p在NIR-II窗口的最大穿透深度超過(guò)2cm，足以支持體內(nèi)成像。

圖2. IR-32p穿透深度測(cè)試的實(shí)驗(yàn)裝置及結(jié)果

 

IR-32p對(duì)體外細(xì)胞（U87MG和NIH/3T3）具低光毒性；即使5倍成像濃度也不會(huì)使小鼠主要器官引起器質(zhì)性病變，不影響血常規(guī)及肝腎功能。總之，體內(nèi)外安全性實(shí)驗(yàn)均顯示IR-32p具有良好的生物相容性，這支持了作者進(jìn)行小鼠體內(nèi)膠質(zhì)瘤成像。

圖3. IR-32p的體內(nèi)外生物相容性

 

使用IR-32p進(jìn)行皮下原位U87MG膠質(zhì)瘤的體內(nèi)NIR-IIa熒光成像，同時(shí)使用IR-32p+cRGDfK共注射作為阻斷組以評(píng)估IR-32p對(duì)整合素αvβ3受體的特異性（cRGDfK注射劑量為IR-32p的10倍以競(jìng)爭(zhēng)αvβ3受體）。在3h時(shí)開(kāi)始有明顯可區(qū)分的信號(hào)，強(qiáng)度在6h達(dá)到最大，比阻斷組高約2倍；而阻斷組腫瘤熒光信號(hào)在各時(shí)間點(diǎn)均有降低，其輕微的信號(hào)積累可能歸因于EPR效應(yīng)。

另外，分別進(jìn)行NIR-I和NIR-II激發(fā)下的體內(nèi)PA成像，PA信號(hào)均在5 h時(shí)最強(qiáng)，且明顯高于阻斷組，與熒光成像一致；但在1020 nm處可觀察到更高的對(duì)比度。

以上結(jié)果說(shuō)明了IR-32p具有出色的主動(dòng)靶向能力，積累量高，可實(shí)現(xiàn)清晰、快速的腫瘤可視化。

圖4. 皮下原位膠質(zhì)瘤NIR-II PA/NIR-IIa熒光成像

 

在出色的皮下成像質(zhì)量的激勵(lì)下，作者研究了IR-32p對(duì)原位腦膠質(zhì)瘤模型的雙模態(tài)成像能力。在U87MG正位腦膠質(zhì)瘤小鼠模型中，IR-32p作用后3 h，腫瘤部位即可見(jiàn)清晰的熒光信號(hào)，6 h內(nèi)熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，達(dá)到超高對(duì)比度；并且在去除頭皮后，大腦和膠質(zhì)瘤的形態(tài)更加清晰。這表明了IR-32p克服完整顱骨和頭皮屏障的深組織穿透能力。

離體生物分布研究發(fā)現(xiàn)IR-32p主要在肝臟、脾臟和腎臟中積累，表明了其肝臟和腎臟的清除途徑。離體腦圖像還進(jìn)一步證實(shí)了IR-32p特異性靶向αvβ3的能力。

圖5. 原位腦膠質(zhì)瘤NIR-II熒光成像

 

最后，利用NIR-II PA來(lái)評(píng)估腦膠質(zhì)瘤的精確位置信息，充分說(shuō)明了NIR-II 激發(fā)相較于NIR-I激發(fā)的優(yōu)勢(shì)：當(dāng)激發(fā)光從800 nm切換到1020 nm時(shí)，顱骨和頭皮的強(qiáng)信號(hào)幾乎消失；在NIR-II PA成像中，從膠質(zhì)瘤中心點(diǎn)到顱骨的深度和高度可準(zhǔn)確地測(cè)量，取得與MRI一致的結(jié)果；在代表性圖像中，NIR-II PA成像的腫瘤與正常組織之比（T/NT）約為NIR-I PA成像的8倍。

阻斷實(shí)驗(yàn)中，24 h內(nèi)未檢測(cè)到膠質(zhì)瘤的明顯PA信號(hào)，驗(yàn)證了IR32p對(duì)膠質(zhì)瘤的主動(dòng)靶向能力。根據(jù)H&E染色，IR-32p處理組和阻斷組膠質(zhì)瘤的面積、大小和形態(tài)與MRI或NIR-II PA成像結(jié)果一致。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了NIR-II相對(duì)于NIR-I PA成像在原位膠質(zhì)瘤成像中的優(yōu)越性。

圖6. 原位腦膠質(zhì)瘤NIR-I / NIR-II PA成像

 

總之，本研究合理設(shè)計(jì)并合成了小分子αvβ3靶向NIR-II PA/NIR-IIa探針I(yè)R-32p，用于NIR-II激發(fā)下膠質(zhì)瘤的靶向成像。IR-32p的寬帶吸收使得NIR-I和NIRII的PA成像成為可能。IR-32p具有優(yōu)異的生物相容性和優(yōu)越的光物理性能，可在NIR-II激發(fā)下對(duì)U87MG皮下膠質(zhì)瘤進(jìn)行NIR-II PA/NIR-IIa熒光雙模成像，比NIR-I激發(fā)具有更深的穿透性和更高的腫瘤靶向?qū)Ρ榷龋�使IR-32p成為未來(lái)臨床應(yīng)用中深部原位腦膠質(zhì)瘤檢測(cè)的有希望的候選者。

 

參考文獻(xiàn)

Lyu S, Lu S, Gui C, Guo C, Han J, Xiao Y, Zhang R, Hong X. A NIR-II Photoacoustic/NIR-IIa Fluorescent Probe for Targeted Imaging of Glioma under NIR-II Excitation. J Med Chem. 2024 Feb 8;67(3):1861-1871

 

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