植物活體成像助力發(fā)現(xiàn)NRPD4與RNA聚合酶IV和V的關(guān)系

 https://genesdev.cshlp.org/content/23/3/318

研究背景

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DNA甲基化是一種表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，保存在植物、哺乳動(dòng)物和一些真菌中。它在表觀遺傳過程中發(fā)揮重要作用，如轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄沉默、參數(shù)化、印跡和X失活。在植物中，24核苷酸（nt）siRNAs可以指導(dǎo)序列特異性DNA甲基化。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，piwi-interacting small RNAs（piRNAs）和某些內(nèi)源性siRNAs也可以指導(dǎo)DNA甲基化。在裂殖酵母中，沒有DNA甲基化，但是siRNAs仍然可以通過指導(dǎo)異染色組蛋白修飾來觸發(fā)轉(zhuǎn)錄基因沉默（TGS）。

植物異染色質(zhì)siRNAs長度為24nt，其產(chǎn)生途徑依賴于RNA依賴的RNA聚合酶2（RDR2）和Dicer-like3（DCL 3）。該途徑還需要PolIV，一種植物特有的，推測為DNA依賴性RNA聚合酶。有趣的是，siRNAs的功能不僅取決于效應(yīng)蛋白Argonaute 4（AGO4）,染色質(zhì)重塑蛋白DRD1和新的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DRM2，還取決于另一種植物特有的推測為DNA依賴性RNA聚合酶Pol IVb/PolV。PolIV被推測為轉(zhuǎn)錄甲基化DNA，以產(chǎn)生作為RDR2底物的初始轉(zhuǎn)錄物。然而，無論在體內(nèi)還是體外這種活性尚未得到證實(shí)。最近，PolV和DRD1被發(fā)現(xiàn)是產(chǎn)生無帽和非聚腺苷化RNAs所必需的，這些RNAs可以作為異染色質(zhì)siRNAs結(jié)合的支架，而異染色質(zhì)siRNAs是DNA甲基化的特異性向?qū)А?   

在ros1突變體中，nrpd4-1突變抑制TGS

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除了已知的7個(gè)基因突變體外，一種新的突變體rdm2-1（后來被重命名為nrpd4-1或nrpe4-1）也被鑒定為ros1抑制因子。圖2A顯示了野生型、ros1和ros1nrpd-1的發(fā)光表型。結(jié)果顯示，經(jīng)過冷處理后，ros1nrpd4-1發(fā)出的發(fā)光強(qiáng)與ros1相比，盡管其發(fā)光仍弱于野生型。結(jié)果表明，ros1中的RD29A-LUC的沉默部分受到nrpd4突變抑制。

ros1nrpd4-1植株的發(fā)光表型表明，nrpd4-1突變抑制了RD29A-LUC轉(zhuǎn)基因的TGS。Northern blot檢測顯示，內(nèi)源性RD29A mRNA水平高于ros1，但低于野生型（圖2B）。這些結(jié)果表明，nrpd4-1突變部分抑制了RD29A-LUC轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性RD29A基因的沉默。野生型、ros1和ros1nrpd4-1植株在18S rRNA負(fù)載控制或冷脅迫誘導(dǎo)的COR15A基因冷處理控制方面沒有差別（圖2B）。綜上所述，這些結(jié)果表明nrpd4-1突變部分抑制內(nèi)源RD29A和RSD29A-LUC轉(zhuǎn)基因的TGS。  

TGS在ros1nrpd4-1突變體中受到抑制

NRPD4/NRPE4與NRPD1和NRPE1相互作用

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由于NRPD4/NRPE4和PRB4之間的高度相似，以及我們發(fā)現(xiàn)NRPD4/NRPE4在RdDM通路中的功能，我們想知道NRPD4是否可能是POl IV和/或Pol V的一個(gè)功能亞基，我們進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來檢測NRPD4/NRPE4與POl IV或Pol V的最大亞基的關(guān)聯(lián)。從NRPD1-Flag轉(zhuǎn)基因植株、NPRE1-Flag轉(zhuǎn)基因植株或未轉(zhuǎn)基因的野生型植株中提取蛋白質(zhì)與抗NRPD4/NRPE4抗體孵育，然后用蛋白A瓊脂糖珠沉淀。將結(jié)合蛋白復(fù)合物洗滌后洗脫，用抗Flag抗體進(jìn)行Western blot分析，檢測NRPD1a/NRPD1或NRPD1b/NRPE1是否與NRPD4/NRPE4免疫共沉淀。分析顯示NRPD1-Flag（圖8A）和NRPE1-Flag（圖8B）都可以被NRPD4/NRPE4抗體共沉淀。結(jié)果表明，NRPD4/NRPE4在體內(nèi)可以與NRPD1和NRPE1相互作用。因此，NRPD4/NRPE4可能在POl IV和Pol V中作為亞基起作用。

NRPD4/NRPE4與NRPD1和NRPE1相互作用          

研究結(jié)果

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證明了RDM2不是RPB4的直系同源，相反，它是PolIV和PolV的一部分；Pol IV和PolV是多亞基酶，NRPD4/NRPE4亞基是從PolII的祖先RPB4亞基進(jìn)化而來的，但是已經(jīng)分化為承擔(dān)RdDM途徑的特定功能。

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植物突變體篩選（低溫CCD相機(jī)檢測）、RNA印跡、酵母雙雜交、DNA甲基化測定、RT-PCR分析、免疫共沉淀和免疫印跡法、免疫染色等。

小編感悟：初次寫類似文字，自身有很多不足，會(huì)在今后努力提高的。欲善其事，必先利其器。新基因、機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，不只是需要專業(yè)的人才，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，專業(yè)的檢測設(shè)備也是不可缺少的。 

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