植物暗箱系統(tǒng)助力揭示辣椒中的蛋白CaCIPK13參與抗寒防御的機制

西北農(nóng)林科技大學(xué)鞏振輝教授團隊近年來在高水平學(xué)刊發(fā)表了一系列關(guān)于辣椒抗性的論文，該研究得到了國家自然科學(xué)基金項目的資助。

博士生馬瀟為第一作者，在“Journal of Experimental Botany”期刊發(fā)表了“The CBL-interacting protein kinase CaCIPK13 positively regulates defence mechanisms against cold stress in pepper ”，該博士生的一系列成果令人印象深刻。

CaCIPK13蛋白：團隊先從辣椒中分離出一個冷誘導(dǎo)的CIPK基因，命名為CaCIPK13，它編碼一487個氨基酸的蛋白質(zhì)。CaCIPK13是一個典型的CIPK家族成員，具有保守的NAF基序，由天冬酰胺、丙氨酸和苯丙氨酸組成。CaCIPK13蛋白位于細胞核和質(zhì)膜中。

VIGS沉默分析：CaCIPK13 沉默會導(dǎo)致辣椒對冷脅迫的敏感性增強，丙二醛含量、H₂O₂累積和電解質(zhì)滲漏增加；花青素含量降低，過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性降低。與空載體對照相比，CaCIPK13沉默的葉片中，低溫和花青素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。反之，通過培育轉(zhuǎn)基因番茄植株，過表達CaCIPK13可增加花青素含量和活性氧清除酶的活性，從而提高耐寒性。          

此外，通過Y2H分析/BIFC實驗/LCI分析，證明CaCIPK13 與 CaCBL1/6/7/8 存在相互作用，揭示CaCIPK13 通過CBL-CIPK 信號系統(tǒng)正向調(diào)控辣椒的耐寒性。
 

要點分析

要點一：CaCIPK13的序列和系統(tǒng)進化分析

CaCIPK13 與 SlCIPK1 、NtCIPK1 、 MdCIPK1 和 VvCIPK1 同屬一個亞群，與SlCIPK1 的關(guān)系最為密切（圖 1B）。通過同源建模預(yù)測的CaCIPK13晶體結(jié)構(gòu)如圖 1C所示，重要特征用不同顏色標(biāo)出，其中跨膜螺旋為黃色，NAF基序為紅色，PPI基序為綠色。

要點二：CaCIPK13的表達模式和亞細胞定位

CaCIPK13是被冷脅迫逐漸誘導(dǎo)的（圖 2A）。對辣椒'P70'中的表達模式進行了qRT-PCR 分析。在冷脅迫下，CaCIPK13的表達量升高，并在12小時后達到峰值（62.4 倍；圖 2B）。在莖、根、葉、花、綠果和紅果等組織中都檢測到了CaCIPK13的轉(zhuǎn)錄水平。空間表達顯示，CaCIPK13 在葉片（7.5 倍）和花朵（6.4 倍）中的表達量較高，其次是根（2.9 倍）和莖（1.0 倍，相較對照組），而在綠果（0.9 倍）和紅果（0.6 倍）中的表達量較低（圖 2C）。利用農(nóng)桿菌GV3101將帶有GFP蛋白的CaCIPK13 載體瞬時表達在煙葉表皮細胞中，空的GFP蛋白分布于整個細胞，CaCIPK13蛋白則分布于細胞核和質(zhì)膜中（圖2D）。

要點三：沉默CaCIPK13可降低辣椒的抗寒性

從陰性對照和CaCIPK13沉默植株中選擇生長一致的幼苗進行冷脅迫，12小時后，CaCIPK13 沉默的植株嚴(yán)重枯萎（圖3B）。測量PSII的最大光化學(xué)效率（ Fv/Fm ） （ 圖 3C ）， 冷處理后 ，CaCIPK13沉默植株的 Fv/Fm 降低（圖 3D），并且膜損傷指數(shù)REL 增加了（圖 3E）。

冷脅迫下，CaCIPK13沉默植株膜損傷指數(shù)MDA含量也有所增加，CaCIPK13沉默葉片比對照積累了更多的 H₂O₂（圖 4B, C），對照植株的 CAT、SOD 和 POD 活性高于CaCIPK13沉默的植株（圖 4D-F）。

沉默CaCIPK13可降低冷誘導(dǎo)基因的表達（圖 5A-D）。低溫處理 4 d后，對照植株的花青素含量高于CaCIPK13沉默的植株（圖 5E）。與花青素生物合成有關(guān)的基因 CaANS 、 CaF3H 和CaCHS 在CaCIPK13沉默植株中下調(diào)（圖 5F-H）。

 要點四：CaCIPK13在番茄中的過表達可增強耐寒性

三個 CaCIPK13表達量較高的轉(zhuǎn)基因番茄T3株系（OE-2、OE-3 和 OE-4）（圖 6A、B）。與 OE-2 株系相比，OE-3 和 OE-4 株系的 CaCIPK13表達量更高（圖 6B）。在冷脅迫下，OE 株系和 WT 株系都表現(xiàn)出枯萎，但 WT株系的枯萎更為嚴(yán)重（圖 6C）。CaCIPK13過表達植株對冷脅迫的耐受性增強。對 PSII 最大光化學(xué)效率的分析表明，WT 葉片的 Fv/Fm 大大降低（圖 6D、E）。在正常條件下，WT 和 OE 植物的 REL 沒有差異。冷脅迫導(dǎo)致 WT 植株 REL數(shù)值比 OE 植株更高（圖 6F）。

MDA 含量的變化趨勢與 REL 相同（圖 7A）。H₂O₂含量也有類似的變化趨勢。冷處理后，與OE葉片相比，WT植物的葉片被DAB 深染成棕色（圖 7B, C）。與 WT 相比，OE 植物在冷脅迫后 CAT、POD 和SOD 的活性大大提高（圖 7D-F）。      

同時，與 WT 植株相比，低溫相關(guān)基因 SlCBF1、SlCBF2、SlCBF3、SlKIN 和 SlCOR47-like 在 OE 中的表達上調(diào)幅度更大（圖 8A-E）�；ㄇ嗨睾�量的測定顯示，冷處理 4 d 后，OE植株的花青素含量增加（圖 8F）。分析了冷脅迫下花青素相關(guān)基因（SlANS、SlF3H和 SlCHS ）的轉(zhuǎn)錄水平，與 WT相比，過表達CaCIPK13 的植株在冷脅迫下的花青素相關(guān)基因（SlANS、SlF3H 和 SlCHS）表達量更高，特別是在高表達CaCIPK13的OE-3系中，花青素相關(guān)基因表達是最高的（圖 8G-I）。

要點五：CaCBL1/6/7/8-CaCIPK13的相互作用對Ca2+有依賴

當(dāng)在含有 X-α-gal 的 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade 培養(yǎng)基上進行篩選時，只有 CaCIPK13 與 CaCBL1/6/7/8 生長良好并變成藍色（圖 9A）。為了驗證CaCIPK13 和 CaCBL1/6/7/8 之間的相互作用，進一步進行了BiFC分析。在煙草葉片表皮細胞中，觀察到黃色熒光信號出現(xiàn)在質(zhì)膜（圖 9B）。

隨后的 LCI 結(jié)果顯示：CaCIPK13與 CaCBL1、CaCBL6、CaCBL7 和 CaCBL8 發(fā)生相互作用（圖 10A）�？紤]到 CaCBLs 和 CaCIPK13 參與鈣信號傳導(dǎo)，CaCl₂ 和 EGTA 處理分別促進和抑制 Ca²⁺ 。與正常情況相比，CaCl₂ 處理時發(fā)光信號增強，而 EGTA處理時發(fā)光信號減弱（圖 10B）。結(jié)果證實，CaCIPK13 與 CaCBL1/6/7/8 之間的相互作用依賴于Ca²⁺。

小編作為設(shè)備方法學(xué)的關(guān)注者，在此羅列了有關(guān)分析方法：

（1）CaCIPK13和 CaCBLs之間的酵母雙雜交（Y2H）分析：為了確定CaCIPK13和9個CaCBLs之間的關(guān)系，用特定引物擴增CaCIPK13的CDS，并將其克隆到pGBKT7-BD 載體的NdeI 和 SalI 位點之間。將pGBKT7- 53 與pGADT7-T 的融合作為陽性對照，而pGBKT7-lam 與 pGADT7-T的融合作為陰性對照。將融合的 pGBKT7-BD 和 pGADT7-AD構(gòu)建物共轉(zhuǎn)入 Y2H Gold 菌株，在SD/-Leu/-Trp上進行篩選，之后接種在含有  X-α-gal 和ABA的培養(yǎng)基ASD/-Leu/-Trp/- His/-Ade中， 30℃下培養(yǎng)3-5 d。

（2）雙分子熒光互補（BiFC）：利用熒光顯微鏡，使用熒光蛋白（YFP、RFP）標(biāo)簽，活體內(nèi)驗證 CaCIPK13 和 CaCBL1/6/7/8 之間的相互作用。CaCIPK13的CDS被克隆到 pUC-pSPYNE載體的 BamHI 和XhoI 位點之間，將CaCBL1、CaCBL6、CaCBL7和CaCBL8的序列克隆到pUC-pSPYCE載體的BamHI和XhoI位點之間。

（3）螢火蟲熒光素酶互補成像（LCI）分析：用熒光素報告基因，再次確認CaCIPK13和CaCBL1/6/7/8 之間的相互作用。通過特異性引物擴增CaCIPK13和CaCBLs（CaCBL1、CaCBL6、CaCBL7、和CaCBL8）的CDS，并分別克隆到 pCAMBIA-nLUC 和 pCAMBIA-cLUC 中。利用低溫CCD-暗箱系統(tǒng)（Lumazone）檢測生物發(fā)光，曝光時間8分鐘。將葉圓片置于含有 CaCl₂ (20 mM) 或 EGTA (20mM) 的瓊脂培養(yǎng)基中24小時，用來促進或抑制 Ca²⁺信號。

非常感謝西北農(nóng)林科技大學(xué)研究團隊的工作成果，讓我們有機會學(xué)習(xí)與分享。

原文信息：The CBL-interacting protein kinase CaCIPK13 positively regulates defence mechanisms against cold stress in pepper

作者：Xiao Ma，Zhen-Hui Gong et al.
單位：College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi, P. R. China
期刊：Journal of Experimental Botany
DOI：https://doi.org/10.1093/jxb/erab505

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