植物成像應(yīng)用文獻(xiàn)：TuMV VPg通過與NdhM抑制葉綠體的防御作用

圖1.NbNdhM抵抗TuMV侵染機(jī)制示意圖

首先，作者通過對(duì)TuMV侵染后的本氏煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)NbNdhM基因的表達(dá)水平受病毒侵染的影響。并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其過表達(dá)可以抑制TuMV的復(fù)制，而沉默會(huì)促進(jìn)病毒侵染。其次，進(jìn)一步證明了NbNdhM通過誘導(dǎo)核周葉綠體的聚集抵御TuMV侵染，并且與TuMV VPg進(jìn)行相互作用。此外，研究還顯示不同植物物種的NdhM與不同病毒的蛋白均存在相互作用，表明NdhM可能是病毒侵染植物的共同靶標(biāo)。最后，作者發(fā)現(xiàn)TuMV VPg通過與NdhM的相互作用，改變NdhM的定位并增加核積累，干擾核周葉綠體的聚集，從而抑制葉綠體的防御作用。       

本文要點(diǎn)          

要點(diǎn)一：NbNdhM基因沉默/過表達(dá)實(shí)驗(yàn)       

TuMV侵染初期會(huì)增加NbNdhM的表達(dá)水平，但隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)水平下調(diào)。研究人員利用植物活體成像系統(tǒng)（Lumazone sophia）可視化熒光蛋白標(biāo)記的蕪菁花葉病毒（TuMV-GFP）侵染程度。如圖2b，c所示，在3天后，觀察到感染植物葉片上出現(xiàn)TuMV-GFP的熒光。在4天后，NbNdhM沉默植株（TRV：NbNdhM）葉片上的熒光高于對(duì)照組（TRV：00），說明沉默NbNdhM后會(huì)促進(jìn)TuMV侵染。圖3a-c則證明了過表達(dá)NbNdhM可以抑制TuMV的侵染。    

圖2.沉默NbNdhM促進(jìn)TuMV侵染

圖3.過表達(dá)NbNdhM抑制TuMV侵染

要點(diǎn)二：NbNdhM誘導(dǎo)核周葉綠體聚集抵御TuMV侵染    

過表達(dá)NbNdhM可以促進(jìn)葉綠體圍繞細(xì)胞核聚集，防御TuMV侵染。而沉默NbNdhM則會(huì)導(dǎo)致抑制這種聚集現(xiàn)象。

圖4.NbNdhM誘導(dǎo)核周葉綠體聚集

要點(diǎn)三：TuMV蛋白VPg與NbNdhM的相互作用

作者通過酵母雙雜交（Y2H）、熒光素酶互補(bǔ)成像（LCI）、免疫共沉淀（Co-IP）以及熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（BiFC）等多種方法證明了TuMV蛋白VPg與NbNdhM的相互作用。             

圖6.TuMV VPg與NbNdhM相互作用

(a)Y2H實(shí)驗(yàn)，表明蕪菁花葉病毒（TuMV）VPg與NbNdhM存在相互作用。將pGBKT7-53 + pGADT7-T共轉(zhuǎn)化到酵母Y2HGold中作為陽性對(duì)照；pGBKT7 + pGADT7-NbNdhM，pGBKT7-TuMV VPg + pGADT7-T以及pGBKT7-Lam + pGADT7-T作為陰性對(duì)照。共轉(zhuǎn)化的酵母在含有X-α-gal和AbA的選擇培養(yǎng)基SD-Ade-His-Leu-Trp中，30℃下培養(yǎng)4-6天。

(b)LCI實(shí)驗(yàn)，表明TuMV VPg與NbNdhM存在相互作用。在熒光素存在的情況下，共表達(dá)cLUC-NbNdhM和TuMV VPg-nLUC產(chǎn)生了生物發(fā)光信號(hào)；β-葡萄糖苷酸酶（GUS）為非相互作用蛋白，作為陰性對(duì)照。使用Lumazone Sophia 2048B植物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)。

(c)Co-IP實(shí)驗(yàn)，表明TuMV VPg與NbNdhM存在相互作用。NbNdhM-GFP和TuMV VPg-cMyc在本氏煙草葉片中共表達(dá)。以空GFP、TuMV VPg-cMyc、NbNdhM-GFP和GUSp-cMyc的共表達(dá)作為陰性對(duì)照。

(d)BiFC實(shí)驗(yàn)，表明TuMV VPg與NbNdhM存在相互作用。NbNdhM的C端與YFP的N端片段融合，TuMV VPg與YFP的C端片段融合。 

原文信息：Turnip mosaic virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection
作者：Jianping Chen，F(xiàn)ei Yan et al.
單位：Institute of Plant Virology，China
期刊：Plant, Cell & Environment
原文鏈接：https://doi.org/10.1111/pce.14157

技術(shù)應(yīng)用 

熒光素酶互補(bǔ)成像實(shí)驗(yàn)（LCI技術(shù)）：將熒光素酶蛋白分為N端和C端2個(gè)功能片段, 即NLuc和CLuc。待測(cè)的2個(gè)目的蛋白分別與N-Luc和C-Luc融合。當(dāng)2個(gè)目標(biāo)蛋白相互作用時(shí)，NLuc和C-Luc緊密結(jié)合，恢復(fù)熒光素酶的催化活性，促使熒光素酶底物氧化而發(fā)光。通過植物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)生物發(fā)光的強(qiáng)度，從而對(duì)蛋白之間的相互作用進(jìn)行定性和定量分析。此方法已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物相關(guān)領(lǐng)域的蛋白質(zhì)互作研究。

植物活體成像系統(tǒng)(Lumazone)應(yīng)用：高通量突變體篩選、逆境處理研究、生物節(jié)律、激素信號(hào)、蛋白互作等實(shí)驗(yàn)，以及甲基化和鈣信號(hào)傳導(dǎo)等極弱信號(hào)生物發(fā)光/熒光成像實(shí)驗(yàn)。