PEAKS Online DIA譜圖庫(kù)與direct Database整合分析詳解

摘要

數(shù)據(jù)非依賴采集(DIA)質(zhì)譜法的發(fā)展是為了提高復(fù)雜數(shù)據(jù)集中蛋白質(zhì)鑒定的重現(xiàn)性。PEAKS提供專門的DIA數(shù)據(jù)分析工作流，其中包括譜圖庫(kù)搜索（SL search）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索（DB search)算法，這些算法是為DIA質(zhì)譜的復(fù)雜性而專門設(shè)計(jì)的。通過(guò)對(duì)人胚胎腎(HEK)細(xì)胞DIA數(shù)據(jù)的分析，譜圖庫(kù)搜索比常規(guī)DDA數(shù)據(jù)方法具有更好的重現(xiàn)性。與測(cè)試的其他方法相比，使用DIA數(shù)據(jù)進(jìn)行直接數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的靈敏度最高。而譜圖庫(kù)搜索和直接數(shù)據(jù)庫(kù)搜索在PEAKS工作流中的結(jié)合提供了一種既準(zhǔn)確、重現(xiàn)性又高的方法。

簡(jiǎn)介

DIA是采集預(yù)設(shè)定m/z窗口范圍內(nèi)的所有母離子進(jìn)行二級(jí)碎裂，因此即使樣本不進(jìn)行二維組份分離，也能基本上涵蓋所有質(zhì)量范圍。而DDA是通過(guò)Top N的方式選擇母離子進(jìn)行碎裂，即使設(shè)定多輪掃描，也會(huì)丟失一些信號(hào)。因此，DIA生成的是無(wú)偏的、高度可重復(fù)的，但復(fù)雜度比較高的譜圖數(shù)據(jù)，通常包含來(lái)自幾個(gè)共洗脫肽段的碎片離子(Fig 1)。

Fig 1. DDA-MS vs. DIA-MS comparison

為了分析DIA數(shù)據(jù)集的復(fù)雜譜圖，PEAKS提供了兩種分析方法：譜圖庫(kù)搜索（SL search）和直接數(shù)據(jù)庫(kù)搜索（DB search）。PEAKS的SL search是從DDA譜圖庫(kù)中找到與DIA數(shù)據(jù)中特征相匹配的多肽，從而實(shí)現(xiàn)鑒定，包括碎片離子特征、索引保留時(shí)間(iRT)和離子遷移率(IM)等。PEAKS DIA DB search工作流是直接根據(jù)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)生成預(yù)測(cè)的譜圖庫(kù)，然后進(jìn)行DIA數(shù)據(jù)的解析。

深度學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)的多肽信息包括碎片離子、iRT、IM等。SL search和DB search可以單獨(dú)運(yùn)行，也可以同時(shí)運(yùn)行。當(dāng)同時(shí)運(yùn)行時(shí)，首先使用SL search進(jìn)行匹配，然后，在選定的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)范圍內(nèi)沒(méi)有可信匹配的譜圖再使用DB  search進(jìn)行分析。

Fig 2. PEAKS Online DIA Workflow

 

方法

Table1 DDA analysis and Spectral library generation parameters

Parameter	Parameter
Precursor mass tolerance	10 ppm
Fragment mass tolerance	0.02 Da
Modifications	Carbamidomethylation（Fix）
Enzyme	Trypsin
Digestmode	Specific
Maximum missed cleavage	3
Database	Revieweduniprot human-20230906
PSM FDR	1%
Protein FDR	1
Minimum unique peptides	1

 

Table 2 DIA Spectral Library search parameters

Parameter	Parameter
Precursor mass tolerance	10 ppm
Fragment mass tolerance	0.02 Da
Peptide length	7-30
PSM FDR	1%
Protein Group FDR	1%
Database	Reviewed uniprot human-20230906
Spectral library	From table 1

 

 Table 3 DIA database search parameters

Parameter	Parameter
Precursor mass tolerance	10 ppm
Fragment mass tolerance	0.02 Da
Modifications	Carbamidomethylation（Fix）
Enzyme	Trypsin
Digestmode	Specific
Maximummissed cleavage	3
Peptide length	7-30
Database	Reviewed uniprothuman-20230906
PSM FDR	1%
Protein FDR	1%
Minimum unique peptides	1

結(jié)果

Fig 3. Protein and peptide total number of identifications. Protein and PSM were both within 1% FDR.

 

Fig 4. DIA library search protein (A) and peptide (B) reproducibility.

 

Fig 5. DIA database search protein (A) and peptide (B) reproducibility.

 

 

Fig 6. DIA Workflow (Spectral library search then DB search) protein (A) and peptide(B) reproducibility.

 

 

Fig 7. DDA Database search protein (A) and peptide (B) reproducibility.

PEAKS Online的DIA全工作流（包括譜圖庫(kù)搜索和直接數(shù)據(jù)庫(kù)搜索）鑒定到最多的蛋白和多肽(Fig 3)。分別選取三個(gè)replicates，對(duì)每種方法的定性結(jié)果及重現(xiàn)性進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果顯示譜圖庫(kù)搜索的重現(xiàn)性最高，在蛋白質(zhì)水平上有95.1%的重復(fù)率，在肽段水平上有75.5%的重復(fù)率(Fig 4)。

在DIA數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果中，靈敏度和重現(xiàn)性之間必然是需要權(quán)衡的，它最靈敏，但是重現(xiàn)性相對(duì)來(lái)說(shuō)就會(huì)比譜圖庫(kù)搜索稍微低一些(92.7%, Fig 5a)。DIA全工作流在重現(xiàn)性和靈敏度之間達(dá)成了最佳組合 (Fig 6)。與DDA數(shù)據(jù)庫(kù)搜索方法相比，DIA搜索方法的靈敏度和重現(xiàn)性都更高(Fig 4-7)。

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參考文獻(xiàn)

1.Fernández-Costa C, Martínez-Bartolomé S, McClatchy DB, Saviola AJ, Yu NK, Yates JR 3rd. Impact of the Identification Strategy on the Reproducibility of the DDA and DIA Results. J Proteome Res. 2020 Aug 7;19(8):3153-3161.doi: 10.1021/acs.jproteome.0c00153. Epub 2020 Jun 19. PMID: 32510229; PMCID: PMC7898222.

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