通過生物打印液滴和環(huán)形結(jié)構(gòu)體開發(fā)膠原蛋白收縮試驗(yàn)的過程與結(jié)果

圖 4: 3D生物打印膠原（A）液滴在無血清培養(yǎng)基和（B）FBS 補(bǔ)充培養(yǎng)基中 48 小時(shí)后的 NHDF 細(xì)胞骨架分支，以及（C）在無血清培養(yǎng)基和（D）FBS 補(bǔ)充培養(yǎng)基中 72 小時(shí)后的環(huán)�？s放條 = 200 µm。綠色 = 活細(xì)胞，紅色 = 死細(xì)胞。

理程序ImageJ(n=5)   測(cè)量直徑，以井底直徑為參考。分別在孵育6小時(shí)和48小時(shí)后捕獲液滴凝膠圖像。 48小  時(shí)后測(cè)量凝膠表面直徑，直徑變化量為凝膠直徑除以6小  時(shí)后測(cè)量的初始凝膠表面直徑。對(duì)于環(huán)，使用image7 測(cè)  量?jī)?nèi)部空間的面積，并從中提取直徑(SF  n=7,FBS  n=5, control n=5)。在孵育0、24、48和72小時(shí)后捕獲環(huán)的圖像，卷曲的環(huán)從研究中省略。72h后，直徑變化為凝膠直徑除以打印后直接測(cè)得的初始凝膠直徑。  根據(jù)CELLINK 的Calcein  AMandPI活性染色方案，使用Calcein   AM(Invitrogen    eBioscience,Ref   #15560597)和碘化丙啶(Sigma-Aldrich,Ref     #81845-25MG)染色來評(píng)估48和72小時(shí)后的細(xì)胞活力。使用熒光顯微鏡(Olympus  IX73)使用綠色(FITC) 和紅色(XRED) 通道獲取圖像。采用ImageJ 評(píng)估細(xì)胞活力。采用非配對(duì)t 檢驗(yàn)(Prism  8,GraphPad  Software)評(píng)估各組數(shù)據(jù)之間的差異。

結(jié)果和討論
FBS 調(diào)理增加了生物3D 打印膠原液滴和膠原環(huán)的收縮百 分比。在含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基中孵育后，可以觀察到液滴和  環(huán)內(nèi)徑明顯減小(圖3 A-b,D-E)。  當(dāng)比較SF 培養(yǎng)基中的 凝膠直徑和添加FBS 的凝膠直徑時(shí)，可以觀察到液滴和  環(huán)的顯著差異(圖3 C,F)。 這可以歸因于成纖維細(xì)胞在   FBS 存在下的增殖特性。此外，在膠原凝膠中培養(yǎng)的成  纖維細(xì)胞傾向于獲得雙極紡錘體結(jié)構(gòu)和多分支形態(tài)，這  有助于強(qiáng)直性收縮(Mochitate,1991) 。 通常，當(dāng)在膠原 凝膠中生長(zhǎng)時(shí)，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白減少，而蛋 白酶和纖維連接蛋白水平增加。因此，諸如細(xì)胞數(shù)量增加、肌動(dòng)蛋白絲束和表面纖維連接蛋白增加等指標(biāo)也可 歸因于凝膠收縮(Mochitate,1991)。鈣黃素 AM   和碘化丙烯染色的細(xì)胞活力顯示，在 FBS  的存在下，細(xì)胞的雙極分支模式更加明顯(圖4)。此外，  FBS  的存在也與 4 8 和 7 2 小時(shí)后更高的細(xì)胞活力相關(guān)，所有條件下的細(xì)胞活力都超過 95%。

這一結(jié)果是意料之中的，因?yàn)镕BS是一種成熟的細(xì)胞生 長(zhǎng)補(bǔ)充劑。在缺乏FBS 的膠原凝膠中也觀察到超過75%  的活細(xì)胞存活率，這進(jìn)一步支持了生物打印在非理想生  長(zhǎng)補(bǔ)充中的應(yīng)用�？偟膩碚f，生成的數(shù)據(jù)支持將3D 生物 打印用于簡(jiǎn)單的小體積自動(dòng)收縮分析，并顯示出在更復(fù)雜的途徑識(shí)別分析中使用的潛力。

未來的研究可能會(huì)結(jié)合1.DOT給藥和CELLCYTE XW顯微鏡 的收縮跟蹤，以實(shí)現(xiàn)完全優(yōu)化的自動(dòng)化工作流程。此外 ,其他特征或模式可以集成到打印協(xié)議中，例如打印傳 感器或柱子，以誘導(dǎo)機(jī)械應(yīng)變并通過收縮環(huán)進(jìn)行傳感。

結(jié)論
經(jīng)過驗(yàn)證， BIO  ONE 是一種適用于中高通量、低容量、高細(xì)胞活力生物力學(xué)試驗(yàn)的有用工具。膠原液滴和膠原環(huán)的收縮率與細(xì)胞密度和FBS 調(diào)節(jié)有關(guān)。

通過3D 生物打印，可以調(diào)整分配的體積，以最佳地利用有價(jià)值的細(xì)胞和材料。BIO  ONE打印頭的冷卻功能允許自動(dòng)和精確地分配 細(xì)胞膠原蛋白。在這項(xiàng)研究中，與傳統(tǒng)的鑄造全孔板的方法相比，膠原蛋白液滴的消耗減少了800%以上。打印PLURONICS 支持屏障允許更復(fù)雜的膠原蛋白圖案，并可以產(chǎn)生各種形狀。

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