應(yīng)用Ribo-seq技術(shù)量化tRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控
技術(shù)簡(jiǎn)介
在之前的研究中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)編碼序列中存在特異性密碼子偏好，影響了蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。另一方面，在不同物種中，tRNA含量與蛋白質(zhì)合成時(shí)密碼子使用偏倚相關(guān)，并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。這些研究將細(xì)胞通路激活與tRNA含量聯(lián)系起來(lái)。這篇文章的研究目的是通過(guò)對(duì)比非致瘤細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中tRNA豐度，揭示tRNA的調(diào)節(jié)效應(yīng)以及在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮的作用。
研究者首先對(duì)不同細(xì)胞系（非致瘤上皮細(xì)胞系MCF10a，低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-231和CN34，以及相對(duì)應(yīng)的高轉(zhuǎn)移亞系MDA-LM2和CN-LM1a）的tRNA進(jìn)行測(cè)序和定量，發(fā)現(xiàn)兩組低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞為獲得更高的轉(zhuǎn)移能力而選擇相似的tRNA豐度調(diào)節(jié)模式，并證實(shí)了特異性tRNA（tRNAArgCCG和tRNAGluUUC）在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，驗(yàn)證了tRNAs表達(dá)上調(diào)后癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力增加（但與細(xì)胞增殖能力無(wú)關(guān)），進(jìn)一步支持了tRNA水平調(diào)節(jié)可以特異性促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)。
研究使用Ribo-seq技術(shù)分別對(duì)對(duì)照組（Control）、tRNAArgCCG過(guò)表達(dá)組（tRNAArg-OE）和tRNAGluUUC過(guò)表達(dá)組（tRNAGlu-OE）細(xì)胞系進(jìn)行分析（Ingolia et al., 2014），檢測(cè)活躍核糖體翻譯組的調(diào)控結(jié)果，用于評(píng)估tRNA上調(diào)對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過(guò)程的影響。通過(guò)這些數(shù)據(jù)，科學(xué)家觀察到了普遍存在的核糖體保護(hù)片段（RPFs，ribosome protected fragments）的周期性和長(zhǎng)度（Figures 4A, 4B, S4B, and S4C）。在過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中，一些基因的相對(duì)核糖體占有率較高，這些基因的編碼序列中富含與特異性tRNA配對(duì)的同源密碼子（Figures 4C and S4D）。根據(jù)上述結(jié)果，測(cè)量了約4000個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平直接評(píng)估tRNA調(diào)節(jié)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。在過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中，與特異性tRNA同源的密碼子含量較高的轉(zhuǎn)錄本普遍穩(wěn)定。
Figure S4. tRNAGluUUC and tRNAArgCCG Overexpression Alters Ribosomal Occupancy and Translational Landscapes, Related to Figure 4
Figure 7. tRNA Preference Scores Were Informative of Differential Ribosome Occupancy and Protein Expression
Figure S7. Differential Protein Expression and tRNA Preference Scores, Related to Figure 7
Ribo-seq，又稱為Ribosome Profiling或者翻譯組測(cè)序，能夠?qū)εc核糖體結(jié)合并正在被翻譯的約30 nt的mRNA片段進(jìn)行測(cè)序，詳細(xì)檢測(cè)體內(nèi)的翻譯狀態(tài)，Ribo-seq是連接轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)之間的橋梁。該技術(shù)可構(gòu)建癌細(xì)胞全基因組水平上蛋白翻譯圖譜，量化蛋白質(zhì)翻譯效率，為基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究提供支持。
2016年發(fā)表在Cell上的“Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression”文章，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的特異性tRNA，這些tRNA通過(guò)增強(qiáng)富含同源密碼子的轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和翻譯來(lái)驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。這篇文章主要通過(guò)三個(gè)關(guān)鍵證據(jù)支持研究者的觀點(diǎn)：
2016年發(fā)表在Cell上的“Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression”文章，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的特異性tRNA，這些tRNA通過(guò)增強(qiáng)富含同源密碼子的轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和翻譯來(lái)驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。這篇文章主要通過(guò)三個(gè)關(guān)鍵證據(jù)支持研究者的觀點(diǎn)：
- 特異性tRNA（tRNAGluUUC和tRNAArgCCG）在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
- tRNAs促進(jìn)了富含其同源密碼子的轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和翻譯。
- tRNAGluUUC通過(guò)直接上調(diào)EXOSC2和增強(qiáng)GRIPAP1來(lái)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移。
在之前的研究中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)編碼序列中存在特異性密碼子偏好，影響了蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。另一方面，在不同物種中，tRNA含量與蛋白質(zhì)合成時(shí)密碼子使用偏倚相關(guān)，并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。這些研究將細(xì)胞通路激活與tRNA含量聯(lián)系起來(lái)。這篇文章的研究目的是通過(guò)對(duì)比非致瘤細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中tRNA豐度，揭示tRNA的調(diào)節(jié)效應(yīng)以及在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮的作用。研究者首先對(duì)不同細(xì)胞系（非致瘤上皮細(xì)胞系MCF10a，低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系MDA-231和CN34，以及相對(duì)應(yīng)的高轉(zhuǎn)移亞系MDA-LM2和CN-LM1a）的tRNA進(jìn)行測(cè)序和定量，發(fā)現(xiàn)兩組低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞為獲得更高的轉(zhuǎn)移能力而選擇相似的tRNA豐度調(diào)節(jié)模式，并證實(shí)了特異性tRNA（tRNAArgCCG和tRNAGluUUC）在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，驗(yàn)證了tRNAs表達(dá)上調(diào)后癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力增加（但與細(xì)胞增殖能力無(wú)關(guān)），進(jìn)一步支持了tRNA水平調(diào)節(jié)可以特異性促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)。
研究使用Ribo-seq技術(shù)分別對(duì)對(duì)照組（Control）、tRNAArgCCG過(guò)表達(dá)組（tRNAArg-OE）和tRNAGluUUC過(guò)表達(dá)組（tRNAGlu-OE）細(xì)胞系進(jìn)行分析（Ingolia et al., 2014），檢測(cè)活躍核糖體翻譯組的調(diào)控結(jié)果，用于評(píng)估tRNA上調(diào)對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過(guò)程的影響。通過(guò)這些數(shù)據(jù)，科學(xué)家觀察到了普遍存在的核糖體保護(hù)片段（RPFs，ribosome protected fragments）的周期性和長(zhǎng)度（Figures 4A, 4B, S4B, and S4C）。在過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中，一些基因的相對(duì)核糖體占有率較高，這些基因的編碼序列中富含與特異性tRNA配對(duì)的同源密碼子（Figures 4C and S4D）。根據(jù)上述結(jié)果，測(cè)量了約4000個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平直接評(píng)估tRNA調(diào)節(jié)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。在過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中，與特異性tRNA同源的密碼子含量較高的轉(zhuǎn)錄本普遍穩(wěn)定。
Figure 4. Post-Transcriptional Consequences of tRNAGluUUC and tRNAArgCCG Upregulation
Figure S4. tRNAGluUUC and tRNAArgCCG Overexpression Alters Ribosomal Occupancy and Translational Landscapes, Related to Figure 4該研究分析了全基因組數(shù)據(jù)并重點(diǎn)關(guān)注了tRNAGluUUC過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的核糖體譜數(shù)據(jù)，確定了當(dāng)tRNAGluUUC豐度更高時(shí)，EXOSC2和GRIPAP1是潛在靶點(diǎn)。這些基因在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞中高表達(dá)，但轉(zhuǎn)錄水平上無(wú)顯著上調(diào)，表明這些基因上調(diào)主要是由轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。
利用Ribo-seq技術(shù)分析核糖體保護(hù)片段（RPF），將tRNA偏好、核糖體占用和蛋白質(zhì)表達(dá)之間相關(guān)聯(lián)。為了量化tRNA含量的變化對(duì)活躍核糖體翻譯組和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，研究者定義了一個(gè)tRNA偏好評(píng)分參數(shù)，并對(duì)轉(zhuǎn)移不良親本細(xì)胞系（MDA-par和CN34-per）及其高轉(zhuǎn)移衍生系（MDA-LM2和CN34-LM1a）進(jìn)行了分析。核糖體保護(hù)片段（RPF）被歸一化為每個(gè)細(xì)胞系的總RNA（TT），用于解釋基因表達(dá)的差異。親本與衍生系之間的RPF/TT比率在生物學(xué)重復(fù)中保持一致，顯著正相關(guān)（Figures 7A and S7A）。將每個(gè)基因的tRNA偏好評(píng)分與其各自矯正的核糖體足跡重疊后，發(fā)現(xiàn)具有較高tRNA偏好評(píng)分的轉(zhuǎn)錄本在那些受核糖體結(jié)合較多的轉(zhuǎn)錄本中強(qiáng)烈富集（Figure 7B）。研究者隨后將每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本豐度進(jìn)行歸一化處理，證實(shí)了高轉(zhuǎn)移亞系中，tRNA偏好得分高的基因顯著富集（Figure 7C）。以上結(jié)果表明，差異tRNA表達(dá)為蛋白質(zhì)翻譯圖譜的改變提供重要信息。
利用Ribo-seq技術(shù)分析核糖體保護(hù)片段（RPF），將tRNA偏好、核糖體占用和蛋白質(zhì)表達(dá)之間相關(guān)聯(lián)。為了量化tRNA含量的變化對(duì)活躍核糖體翻譯組和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，研究者定義了一個(gè)tRNA偏好評(píng)分參數(shù)，并對(duì)轉(zhuǎn)移不良親本細(xì)胞系（MDA-par和CN34-per）及其高轉(zhuǎn)移衍生系（MDA-LM2和CN34-LM1a）進(jìn)行了分析。核糖體保護(hù)片段（RPF）被歸一化為每個(gè)細(xì)胞系的總RNA（TT），用于解釋基因表達(dá)的差異。親本與衍生系之間的RPF/TT比率在生物學(xué)重復(fù)中保持一致，顯著正相關(guān)（Figures 7A and S7A）。將每個(gè)基因的tRNA偏好評(píng)分與其各自矯正的核糖體足跡重疊后，發(fā)現(xiàn)具有較高tRNA偏好評(píng)分的轉(zhuǎn)錄本在那些受核糖體結(jié)合較多的轉(zhuǎn)錄本中強(qiáng)烈富集（Figure 7B）。研究者隨后將每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本豐度進(jìn)行歸一化處理，證實(shí)了高轉(zhuǎn)移亞系中，tRNA偏好得分高的基因顯著富集（Figure 7C）。以上結(jié)果表明，差異tRNA表達(dá)為蛋白質(zhì)翻譯圖譜的改變提供重要信息。
Figure 7. tRNA Preference Scores Were Informative of Differential Ribosome Occupancy and Protein ExpressionFigure S7. Differential Protein Expression and tRNA Preference Scores, Related to Figure 7這項(xiàng)研究證實(shí)了tRNA豐度的改變可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，并且癌細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)節(jié)tRNA水平來(lái)調(diào)整癌癥進(jìn)程中的多數(shù)啟動(dòng)子的表達(dá)。雖然文章中這種tRNA分析方法是基于乳腺癌細(xì)胞系研究，但研究者認(rèn)為在其他疾病、模型和物種中還有更廣闊的應(yīng)用前景。
小結(jié)
Ribo-seq技術(shù)檢測(cè)到核糖體結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本與tRNA表達(dá)顯著相關(guān)，將基因表達(dá)調(diào)控中的轉(zhuǎn)錄過(guò)程與翻譯過(guò)程關(guān)聯(lián)起來(lái)，可以通過(guò)檢測(cè)mRNA核糖體保護(hù)片段（RPF），識(shí)別翻譯過(guò)程中的tRNA調(diào)控事件。Ribo-seq技術(shù)可以與DAP-seq/ChIP-seq、RNA-seq、tRNA-seq和質(zhì)譜等技術(shù)一起，將基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程完整呈現(xiàn)出來(lái)。
引用文獻(xiàn)
Goodarzi H, Nguyen HCB, Zhang S, Dill BD, Molina H, Tavazoie SF. Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression. Cell. 2016. 165(6):1416-1427.
小結(jié)
Ribo-seq技術(shù)檢測(cè)到核糖體結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本與tRNA表達(dá)顯著相關(guān)，將基因表達(dá)調(diào)控中的轉(zhuǎn)錄過(guò)程與翻譯過(guò)程關(guān)聯(lián)起來(lái)，可以通過(guò)檢測(cè)mRNA核糖體保護(hù)片段（RPF），識(shí)別翻譯過(guò)程中的tRNA調(diào)控事件。Ribo-seq技術(shù)可以與DAP-seq/ChIP-seq、RNA-seq、tRNA-seq和質(zhì)譜等技術(shù)一起，將基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程完整呈現(xiàn)出來(lái)。
引用文獻(xiàn)
Goodarzi H, Nguyen HCB, Zhang S, Dill BD, Molina H, Tavazoie SF. Modulated Expression of Specific tRNAs Drives Gene Expression and Cancer Progression. Cell. 2016. 165(6):1416-1427.
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