應用案例：超高速視頻級原子力顯微鏡實時成像CRISPR基因編輯過程
應用案例（超高速視頻級原子力顯微鏡-HS-AFM）：“眼見為實”超高速視頻級原子力顯微鏡實時成像觀察CRISPR基因編輯過程
翻譯整理：北京佰司特科技有限責任公司
超高速視頻級原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大學 Prof. Ando 教授團隊研發(fā)，日本RIBM公司（生體分子計測研究所株式會社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商業(yè)化的產品，可以達到視頻級成像的商業(yè)化原子力顯微鏡。HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢”的限制，能夠在液體環(huán)境下超快速動態(tài)成像，分辨率為納米水平。樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態(tài)觀測。超高速視頻級原子力顯微鏡HS-AFM主要有兩種型號，SS-NEX樣品掃描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探針掃描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，全球已有100多位用戶，發(fā)表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等頂級雜志。翻譯整理：北京佰司特科技有限責任公司
自2012年以來，研究人員常用一種叫做CRISPR的強大“基因組編輯”技術對生物的DNA序列進行修剪、切斷、替換或添加。CRISPR來自微生物的免疫系統(tǒng)，這種工程編輯系統(tǒng)利用一種酶，能把一段作為引導工具的小RNA切入DNA，就能在此處切斷或做其他改變。
CRISPR已經成為生命科學領域受關注的基因編輯技術，其效果得到大家一致認可。雖然科學家可通過RT-PCR、WB等方法間接證明CRISPR的功能，但仍未有直接的證據(jù)來證實。究其原因：一是生物分子間的相互作用速率快，需要高速的成像手段才能捕捉到；二是生物分子比較小，通常為納米級，普通顯微鏡由于受光學衍射限所限不能分辨。日本Kanazawa University的科學家利用超高速視頻級原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）成功觀察到了實時CRISPR基因編輯，為CRISPR技術的有效性提供了直接的證據(jù)。
超高速視頻級原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大學 Prof. Ando 教授團隊研發(fā)，日本RIBM公司（生體分子計測研究所株式會社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商業(yè)化的產品，可以達到視頻級成像的商業(yè)化原子力顯微鏡。HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢”的限制，能夠在液體環(huán)境下超快速動態(tài)成像，分辨率為納米水平。樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態(tài)觀測。超高速視頻級原子力顯微鏡HS-AFM主要有兩種型號，SS-NEX樣品掃描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探針掃描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，全球已有100多位用戶，發(fā)表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等頂級雜志。
相較于目前市場上的原子力顯微鏡成像設備，HS-AFM突破了 “掃描成像速慢”的限制，掃描速度高可達 20 frame/s，并且有 4 種掃描臺可供選擇。樣品無需特殊固定染色，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態(tài)觀測。液體環(huán)境下直接檢測，超快速動態(tài)成像，分辨率為納米水平。探針小，適用于生物樣品；懸臂探針共振頻率高，彈簧系數(shù)小，避免了對生物樣品等的損傷。懸臂探針可自動漂移校準，適用于長時間觀測。采用動態(tài)PID控制，高速掃描時仍可獲得清晰的圖像。XY軸分辨率2nm；Z軸分辨率0.5nm。 HS-AFM不僅擁有超高掃描速率與原子級別分辨率，而且具有操作的簡易性，使得對單分子動態(tài)過程的捕捉變得十分方便，為科研工作者研所和理解生物物理、生物化學、分子生物學、病毒學以及生物醫(yī)學等領域的單分子動態(tài)過程提供了一款強大的工具。 全新的HS-AFM采用了新的高頻微懸臂架構，更低噪音、更高穩(wěn)定性的2控制器，高速掃描器，緩沖防震設計，主動阻尼，動態(tài)PID，驅動算法優(yōu)化，多種前沿技術，可以實現(xiàn)在超高速下獲取高分辨的生物樣品信息。新系統(tǒng)整合了基于工作流程的操作軟件，直觀的用戶界面與流程化、自動化的設置使得研究人員可以專注于實驗設計，不需要復雜的操作和條件設置，快速獲取數(shù)據(jù)，加速研究的產出。
HS-AFM結果直觀顯示構象差異：
HS-AFM視頻結果顯示apo-Cas9為柔性構象（flexible conformations），而Cas9–RNA則為穩(wěn)定的雙葉型構象（stable bilobed architecture）。
Cas9-RNA介導的PAM依賴性DNA識別
Cas9-RNA靶向定位到目的DNA，形成Cas9–RNA–DNA復合體。
Cas9-RNA對目的DNA進行剪切
在Mg2+存在的條件下，Cas9-RNA對目的DNA進行特異性剪切。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-017-01466-8
這項工作的完成主要借助了日本RIBM公司研發(fā)的超高速視頻原子力顯微鏡HS-AFM，HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢”的限制，能夠實現(xiàn)在液體環(huán)境下超快速動態(tài)成像，分辨率為納米水平。待測樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態(tài)觀測。推出至今，全球已有100多位用戶，發(fā)表SCI論文300余篇，其中包括Science, Nature, Cell 等頂級雜志。
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