血流動力通過 MIEN1-ERK/MAPK 信號軸決定內(nèi)皮細胞血管生成
血管生成，涉及從預(yù)先存在的毛細血管中萌發(fā)新的血管，有助于胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和傷口愈合。血管生成或血管修復(fù)的調(diào)控缺失是動脈粥樣硬化的嚴重并發(fā)癥。此外，血管生成異常限制了缺血性疾病的組織恢復(fù)。因此，血管生成在心血管疾病中具有巨大的血管再生潛力。
細胞行為和命運由機械微環(huán)境決定。內(nèi)皮細胞（ECs）的特定機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制參與調(diào)節(jié)細胞命運，從而塑造血管系統(tǒng)以優(yōu)化流向組織的血流。研究發(fā)現(xiàn)，剪切應(yīng)力有效調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞（EPCs），在促進血管生成方面具有巨大潛力。還有報告稱，增加的剪切應(yīng)力通過靜脈叢中的 BMP-依賴性途徑抑制血管生成。因此，剪切應(yīng)力因其在血管再生中的潛在作用而得到認可。然而，不同的血流模式（層流和擾動流）如何決定血管生成在很大程度上仍不清楚。
遷移和侵襲增強子1（MIEN1）是一種在腫瘤組織中廣泛表達的新基因，對細胞的侵襲和遷移具有重要的控制作用。此外，MIEN1 維持肌動蛋白細胞骨架的可塑性以增強細胞運動性。EC 的遷移對血管生成至關(guān)重要，血管生成受機械刺激的定向調(diào)控。EC 對剪切應(yīng)力的響應(yīng)涉及重塑肌動蛋白細胞骨架的多種信號通路的激活，從而促進 EC 的遷移。在血管生成萌芽期間控制 EC 行為的各種信號通路中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號在調(diào)節(jié)血管生成中起著至關(guān)重要的作用。最近，MAPK 信號被證明與血管重塑和發(fā)芽有關(guān)。
最近，在四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室課題人員的一項工作中，初步研究了不同血流模式（生理LSS：15 dyn/cm2；促動脈粥樣硬化血流DSS：0.5 ± 4 dyn/cm2）對體外血管生成的影響，探討了不同血流模式下內(nèi)皮血管生成的變化及其潛在機制。研究結(jié)果顯示，通過 MIEN1-ERK/MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸，擾動流顯著損害了 ECs 的血管生成。這些結(jié)果為擾動剪切應(yīng)力對血管生成的影響提供了直接的見解。詳細研究成果發(fā)表在 The Journal of Cellular Physiology 期刊題為“Hemodynamic force dictates endothelial angiogenesis through MIEN1-ERK/MAPK-signaling axis”。
首先，研究了響應(yīng)不同 FSS 模式的血管樣結(jié)構(gòu)的形成，發(fā)現(xiàn)與擾動流相比，層流中形成的 HUVECs 的血管樣結(jié)構(gòu)更多。VEGF 被認為是血管生成的重要介質(zhì)，能夠刺激血管生成萌芽，包括 VEGFA，VEGFB，VEGFC 和 VEGFD 多種亞型，因此，檢測了四種亞型的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達。結(jié)果表明，與 LSS 相比，DSS 中 VEGFB mRNA 水平下調(diào)，而 VEGFA、C 和 D 的 mRNA 表達顯著增加。蛋白質(zhì)檢測結(jié)果顯示，與 LSS 相比，DSS 中 VEGFB 的表達較低，而兩組之間的 VEGFA、C 和 D 表達無顯著差異。免疫熒光分析證實，與 LSS 相比，DSS 下 HUVECs 的細胞質(zhì)和膜區(qū)域中的 VEGFB 分布顯著降低（圖1 f、g）。
進一步探究 VEFGB 對 FSS 的影響，用 10 ng/mL VEGFB 誘導(dǎo)后，可以發(fā)現(xiàn) ECs 在擾動流條件下傾向于形成血管樣結(jié)構(gòu)（圖1 h）。定量分析證實，誘導(dǎo)擾動組的血管小管和腎小管面積相對對照組增加（圖1 i）。相反，靜態(tài)組和層流組在有或沒有 VEGFB 處理的情況下沒有差異。這些結(jié)果表明，DSS 通過降低 HUVECs 中 VEGFB 的表達來破壞血管生成過程。
接下來，為了探究剪切應(yīng)力誘導(dǎo)血管生成的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，實驗重點關(guān)注了不同流動模式條件下細胞膜和細胞骨架的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HUVECs 中響應(yīng) DSS 的基因數(shù)量減少，特別是 MIEN1 在 DSS 中的 mRNA 和蛋白水平均顯著降低。通過免疫熒光探索 HUVECs 中 MIEN1 的分布（圖2 e、f），觀察到 LSS 組中大量 MIEN1 高表達。此外，MIEN1 在 HUVECs 中呈點狀分布，主要分散在 LSS 組的細胞質(zhì)和膜區(qū)域。
為了研究 MIEN1 在剪切應(yīng)力介導(dǎo)的血管生成中的作用，用 MIEN1 siRNA 轉(zhuǎn)染 HUVECs 降低 MIEN1 蛋白的表達（圖2 a、b、c）。上述結(jié)果表明，DSS 導(dǎo)致 HUVECs 中 VEGFB 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達降低。因此，接下來確定 MIEN1 是否是 VEGFB 表達所必需的。數(shù)據(jù)證實，si-MIEN1 減弱了 VEGFB 的表達，進一步突出了 MIEN1 在此過程中的重要性（圖2 b、d）。同時，進行 MIEN1 的過表達也證實了上述結(jié)果，顯示 MIEN1 的上調(diào)顯著增強了 VEGFB 的表達。
研究證實，暴露于 LSS 的 ECs 表現(xiàn)出比 DSS 更高的 F-肌動蛋白表達水平。因此，研究了不同流動條件下 HUVECs 中微絲的分布。暴露于層流中，HUVECs 顯示出明顯且明確的絲狀 F-肌動蛋白結(jié)構(gòu)，然而在擾動流下，F(xiàn)-肌動蛋白出現(xiàn)分散。隨后使用 si-MIEN1 敲低 MIEN1，發(fā)現(xiàn) LSS 和 DSS 組內(nèi)細胞骨架組織都受到干擾（圖2 e）。此外，MIEN1 的降低擾亂了細胞骨架在微絲（F-肌動蛋白束）形成中的組織（圖2 g）。定量分析顯示，與 LSS 組相比，DSS 組中 F-肌動蛋白的熒光強度降低（圖2 f）。一般來說，DSS 破壞了細胞骨架的結(jié)構(gòu)完整性。然而，MIEN1 過表達組在 DSS 條件下表現(xiàn)出增強的細胞骨架組織能力。
隨后，探討了 MIEN1 在血管生成中的作用。在 LSS 組中，用 si-MIEN1 轉(zhuǎn)染明顯抑制了血管樣結(jié)構(gòu)的形成（圖2 h）。在層流條件下，血管連接處和腎小管面積均降低（圖2 i）。有趣的是，與 DSS 相比，MIEN1 的過表達促進了細胞中血管樣結(jié)構(gòu)的形成。這些結(jié)果表明，DSS 通過調(diào)節(jié)細胞骨架排列和降低 MIEN1 來損害內(nèi)皮血管生成。
實驗探索了響應(yīng) LSS 和 DSS 的細胞質(zhì)信號通路的改變，通過熱圖對響應(yīng)不同剪切應(yīng)力的細胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因進行聚類，發(fā)現(xiàn)與 LSS 相比，DSS 誘導(dǎo)的 HUVECs 中 MAPK 信號的降低最為顯著，且 p-ERK、p-MEK 和 p-p38 的表達顯著降低。然后，使用選擇性 ERK 抑制劑 SCH772984 研究了 ERK/MAPK 信號在 HUVECs 血管生成中的參與。結(jié)果表明，SCH772984 有效地降低了 p-ERK 的表達。在靜態(tài)和流動條件下，SCH772984 處理使血管生成能力明顯減弱。這些發(fā)現(xiàn)表明，剪切應(yīng)力介導(dǎo)的 ERK/MAPK 信號積極參與血管生成，DSS 通過下調(diào) ERK/MAPK 信號阻礙內(nèi)皮血管生成。
此外，實驗發(fā)現(xiàn) p-ERK 在細胞中廣泛分布，特別是在 HUVECs 的細胞核中。有趣的是，與靜態(tài)組和 DSS 組相比，LSS 組表現(xiàn)出更高的 p-ERK 核分布（圖3 a）。熒光定量顯示，LSS 組中 p-ERK 的核積累增加，DSS 組中的核積累減少（圖3 b）。與靜態(tài)條件相比，LSS 下 HUVECs 中 p-ERK 的總水平顯著增加 193.2%，然而，當將 DSS 組與 LSS 組進行比較時，這一水平下降到 55.5%（圖3 c）。研究人員發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SS 通過細胞膜上的 MIEN1 誘導(dǎo)細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)。si-MIEN1 可有效抑制 p-ERK 表達（圖3 d、e），而在 si-MIEN1 HUVECs 中ERK 沒有變化（圖3 d、f）。免疫熒光染色進一步證實，敲低 MIEN1 可降低 HUVECs 中的 p-ERK 表達（圖3 g、h）。這些結(jié)果表明，MIEN1 觸發(fā)內(nèi)皮血管生成中的ERK/MAPK信號。
圖4 示意圖闡明了DSS通過抑制MIEN1-ERK/MAPK信號軸損害HUVECs的血管生成。直動脈暴露于層流（LSS），而在分支或彎曲血管中，血流受到干擾（DSS）。血液流動中的ECs經(jīng)歷機械感應(yīng)和細胞質(zhì)信號變化（ERK/MAPK信號），改變VEGFB表達，從而影響血管生成。DSS 相對于 LSS 會破壞血管生成。
總之，在這項工作中，研究人員提供了強有力的證據(jù)，證明血管生成受到不同剪切應(yīng)力模式的顯著影響。血流流動中的 ECs 通過 MIEN1 和細胞骨架重塑進行機械傳感，導(dǎo)致細胞質(zhì)信號激活（ERK/MAPK信號），從而改變 VEGFB 的表達，調(diào)節(jié)血管生成。這些發(fā)現(xiàn)為響應(yīng)剪切應(yīng)力的血管生成的細胞生物物理變化提供了寶貴的見解。
參考文獻：Cheng L, Shi H, Du L, Liu Q, Yue H, Zhang H, Liu X, Xie J, Shen Y. Hemodynamic force dictates endothelial angiogenesis through MIEN1-ERK/MAPK-signaling axis. J Cell Physiol. 2024 Jan 12. doi: 10.1002/jcp.31177. Epub ahead of print. PMID: 38214132.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38214132
圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻
本文旨在分享、交流生物領(lǐng)域研究進展，關(guān)注“Naturethink”公眾號，了解更多相關(guān)內(nèi)容。
細胞行為和命運由機械微環(huán)境決定。內(nèi)皮細胞（ECs）的特定機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制參與調(diào)節(jié)細胞命運，從而塑造血管系統(tǒng)以優(yōu)化流向組織的血流。研究發(fā)現(xiàn)，剪切應(yīng)力有效調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞（EPCs），在促進血管生成方面具有巨大潛力。還有報告稱，增加的剪切應(yīng)力通過靜脈叢中的 BMP-依賴性途徑抑制血管生成。因此，剪切應(yīng)力因其在血管再生中的潛在作用而得到認可。然而，不同的血流模式（層流和擾動流）如何決定血管生成在很大程度上仍不清楚。
遷移和侵襲增強子1（MIEN1）是一種在腫瘤組織中廣泛表達的新基因，對細胞的侵襲和遷移具有重要的控制作用。此外，MIEN1 維持肌動蛋白細胞骨架的可塑性以增強細胞運動性。EC 的遷移對血管生成至關(guān)重要，血管生成受機械刺激的定向調(diào)控。EC 對剪切應(yīng)力的響應(yīng)涉及重塑肌動蛋白細胞骨架的多種信號通路的激活，從而促進 EC 的遷移。在血管生成萌芽期間控制 EC 行為的各種信號通路中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號在調(diào)節(jié)血管生成中起著至關(guān)重要的作用。最近，MAPK 信號被證明與血管重塑和發(fā)芽有關(guān)。
最近，在四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室課題人員的一項工作中，初步研究了不同血流模式（生理LSS：15 dyn/cm2；促動脈粥樣硬化血流DSS：0.5 ± 4 dyn/cm2）對體外血管生成的影響，探討了不同血流模式下內(nèi)皮血管生成的變化及其潛在機制。研究結(jié)果顯示，通過 MIEN1-ERK/MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)軸，擾動流顯著損害了 ECs 的血管生成。這些結(jié)果為擾動剪切應(yīng)力對血管生成的影響提供了直接的見解。詳細研究成果發(fā)表在 The Journal of Cellular Physiology 期刊題為“Hemodynamic force dictates endothelial angiogenesis through MIEN1-ERK/MAPK-signaling axis”。
首先，研究了響應(yīng)不同 FSS 模式的血管樣結(jié)構(gòu)的形成，發(fā)現(xiàn)與擾動流相比，層流中形成的 HUVECs 的血管樣結(jié)構(gòu)更多。VEGF 被認為是血管生成的重要介質(zhì)，能夠刺激血管生成萌芽，包括 VEGFA，VEGFB，VEGFC 和 VEGFD 多種亞型，因此，檢測了四種亞型的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達。結(jié)果表明，與 LSS 相比，DSS 中 VEGFB mRNA 水平下調(diào)，而 VEGFA、C 和 D 的 mRNA 表達顯著增加。蛋白質(zhì)檢測結(jié)果顯示，與 LSS 相比，DSS 中 VEGFB 的表達較低，而兩組之間的 VEGFA、C 和 D 表達無顯著差異。免疫熒光分析證實，與 LSS 相比，DSS 下 HUVECs 的細胞質(zhì)和膜區(qū)域中的 VEGFB 分布顯著降低（圖1 f、g）。
進一步探究 VEFGB 對 FSS 的影響，用 10 ng/mL VEGFB 誘導(dǎo)后，可以發(fā)現(xiàn) ECs 在擾動流條件下傾向于形成血管樣結(jié)構(gòu)（圖1 h）。定量分析證實，誘導(dǎo)擾動組的血管小管和腎小管面積相對對照組增加（圖1 i）。相反，靜態(tài)組和層流組在有或沒有 VEGFB 處理的情況下沒有差異。這些結(jié)果表明，DSS 通過降低 HUVECs 中 VEGFB 的表達來破壞血管生成過程。
圖1 Matrigel上 HUVECs 的血管生成響應(yīng)不同模式的 FSS。
接下來，為了探究剪切應(yīng)力誘導(dǎo)血管生成的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，實驗重點關(guān)注了不同流動模式條件下細胞膜和細胞骨架的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HUVECs 中響應(yīng) DSS 的基因數(shù)量減少，特別是 MIEN1 在 DSS 中的 mRNA 和蛋白水平均顯著降低。通過免疫熒光探索 HUVECs 中 MIEN1 的分布（圖2 e、f），觀察到 LSS 組中大量 MIEN1 高表達。此外，MIEN1 在 HUVECs 中呈點狀分布，主要分散在 LSS 組的細胞質(zhì)和膜區(qū)域。
為了研究 MIEN1 在剪切應(yīng)力介導(dǎo)的血管生成中的作用，用 MIEN1 siRNA 轉(zhuǎn)染 HUVECs 降低 MIEN1 蛋白的表達（圖2 a、b、c）。上述結(jié)果表明，DSS 導(dǎo)致 HUVECs 中 VEGFB 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達降低。因此，接下來確定 MIEN1 是否是 VEGFB 表達所必需的。數(shù)據(jù)證實，si-MIEN1 減弱了 VEGFB 的表達，進一步突出了 MIEN1 在此過程中的重要性（圖2 b、d）。同時，進行 MIEN1 的過表達也證實了上述結(jié)果，顯示 MIEN1 的上調(diào)顯著增強了 VEGFB 的表達。
研究證實，暴露于 LSS 的 ECs 表現(xiàn)出比 DSS 更高的 F-肌動蛋白表達水平。因此，研究了不同流動條件下 HUVECs 中微絲的分布。暴露于層流中，HUVECs 顯示出明顯且明確的絲狀 F-肌動蛋白結(jié)構(gòu)，然而在擾動流下，F(xiàn)-肌動蛋白出現(xiàn)分散。隨后使用 si-MIEN1 敲低 MIEN1，發(fā)現(xiàn) LSS 和 DSS 組內(nèi)細胞骨架組織都受到干擾（圖2 e）。此外，MIEN1 的降低擾亂了細胞骨架在微絲（F-肌動蛋白束）形成中的組織（圖2 g）。定量分析顯示，與 LSS 組相比，DSS 組中 F-肌動蛋白的熒光強度降低（圖2 f）。一般來說，DSS 破壞了細胞骨架的結(jié)構(gòu)完整性。然而，MIEN1 過表達組在 DSS 條件下表現(xiàn)出增強的細胞骨架組織能力。
隨后，探討了 MIEN1 在血管生成中的作用。在 LSS 組中，用 si-MIEN1 轉(zhuǎn)染明顯抑制了血管樣結(jié)構(gòu)的形成（圖2 h）。在層流條件下，血管連接處和腎小管面積均降低（圖2 i）。有趣的是，與 DSS 相比，MIEN1 的過表達促進了細胞中血管樣結(jié)構(gòu)的形成。這些結(jié)果表明，DSS 通過調(diào)節(jié)細胞骨架排列和降低 MIEN1 來損害內(nèi)皮血管生成。
圖 2 MIEN1是剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)血管生成所必需的。
實驗探索了響應(yīng) LSS 和 DSS 的細胞質(zhì)信號通路的改變，通過熱圖對響應(yīng)不同剪切應(yīng)力的細胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因進行聚類，發(fā)現(xiàn)與 LSS 相比，DSS 誘導(dǎo)的 HUVECs 中 MAPK 信號的降低最為顯著，且 p-ERK、p-MEK 和 p-p38 的表達顯著降低。然后，使用選擇性 ERK 抑制劑 SCH772984 研究了 ERK/MAPK 信號在 HUVECs 血管生成中的參與。結(jié)果表明，SCH772984 有效地降低了 p-ERK 的表達。在靜態(tài)和流動條件下，SCH772984 處理使血管生成能力明顯減弱。這些發(fā)現(xiàn)表明，剪切應(yīng)力介導(dǎo)的 ERK/MAPK 信號積極參與血管生成，DSS 通過下調(diào) ERK/MAPK 信號阻礙內(nèi)皮血管生成。
此外，實驗發(fā)現(xiàn) p-ERK 在細胞中廣泛分布，特別是在 HUVECs 的細胞核中。有趣的是，與靜態(tài)組和 DSS 組相比，LSS 組表現(xiàn)出更高的 p-ERK 核分布（圖3 a）。熒光定量顯示，LSS 組中 p-ERK 的核積累增加，DSS 組中的核積累減少（圖3 b）。與靜態(tài)條件相比，LSS 下 HUVECs 中 p-ERK 的總水平顯著增加 193.2%，然而，當將 DSS 組與 LSS 組進行比較時，這一水平下降到 55.5%（圖3 c）。研究人員發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SS 通過細胞膜上的 MIEN1 誘導(dǎo)細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)。si-MIEN1 可有效抑制 p-ERK 表達（圖3 d、e），而在 si-MIEN1 HUVECs 中ERK 沒有變化（圖3 d、f）。免疫熒光染色進一步證實，敲低 MIEN1 可降低 HUVECs 中的 p-ERK 表達（圖3 g、h）。這些結(jié)果表明，MIEN1 觸發(fā)內(nèi)皮血管生成中的ERK/MAPK信號。
圖3 MIEN1在內(nèi)皮血管生成中觸發(fā)ERK/MAPK信號。
總之，在這項工作中，研究人員提供了強有力的證據(jù)，證明血管生成受到不同剪切應(yīng)力模式的顯著影響。血流流動中的 ECs 通過 MIEN1 和細胞骨架重塑進行機械傳感，導(dǎo)致細胞質(zhì)信號激活（ERK/MAPK信號），從而改變 VEGFB 的表達，調(diào)節(jié)血管生成。這些發(fā)現(xiàn)為響應(yīng)剪切應(yīng)力的血管生成的細胞生物物理變化提供了寶貴的見解。
參考文獻：Cheng L, Shi H, Du L, Liu Q, Yue H, Zhang H, Liu X, Xie J, Shen Y. Hemodynamic force dictates endothelial angiogenesis through MIEN1-ERK/MAPK-signaling axis. J Cell Physiol. 2024 Jan 12. doi: 10.1002/jcp.31177. Epub ahead of print. PMID: 38214132.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38214132
圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻
本文旨在分享、交流生物領(lǐng)域研究進展，關(guān)注“Naturethink”公眾號，了解更多相關(guān)內(nèi)容。
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