M2點樣儀助力生物傳感器芯片用于發(fā)現(xiàn)癌癥免疫標(biāo)志物

免疫檢查點（Immune Checkpoint）是一類免疫抑制分子，免疫檢查點阻斷療法通過抑制程序性死亡受體及其配體結(jié)合,從而提高宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的攻擊性。尤其是免疫檢查點阻斷(ICB)抑制劑的發(fā)現(xiàn)，極大改善了癌癥患者的預(yù)后�；�于液體活檢的生物標(biāo)志物體外診斷方法，可以使ICB治療盡可能延緩腫瘤的進(jìn)展、延長患者生存期并提高患者生活質(zhì)量。與目前臨床基于化學(xué)發(fā)光和吸光度法的酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）相比，熒光免疫法（FIA）不依賴于酶活性或底物濃度，具有更好的靈敏度，然而熒光團(tuán)的低量子產(chǎn)率，有限的光穩(wěn)定性和強(qiáng)自身熒光背景等因素制約，難以進(jìn)一步被臨床廣泛應(yīng)用。近年納米技術(shù)的發(fā)展，促使具有表面等離子體共振的金屬納米結(jié)構(gòu)，可通過金屬熒光增強(qiáng)效應(yīng)（MEF）有效放大熒光信號，以達(dá)到高敏診斷，同時長波近紅外熒光(NIRF)具有較低的自身熒光干擾，明顯提高檢測結(jié)果的靈敏度和信噪比。因此，高靈敏度、高通量、能同時檢測多種生物標(biāo)志物的體外診斷方法，對于推動腫瘤患者的診斷、治療和預(yù)后尤為重要。

近期，來自華南腫瘤國家重點實驗室，廣東省鼻咽癌診療重點實驗室以及中山大學(xué)腫瘤防治中心的楊江教授報道了一種基于生物傳感器，用于高敏檢測可溶性免疫檢查點預(yù)測分子sICAM-1（細(xì)胞間黏附分子-1）和sPD-L1（細(xì)胞程序性死亡-配體1）的文章，題目為“A near-infrared fluorescence-enhancing plasmonic biosensing microarray identifies soluble PD-L1 and ICAM-1 as predictive checkpoint biomarkers for cancer immunotherapy”于2023年8月發(fā)表在國際生物傳感器權(quán)威雜志Biosensors and Bioelectronics上。

該研究團(tuán)隊合成了一種基于金納米島狀結(jié)構(gòu)（AuNIS）的增強(qiáng)近紅外熒光微陣列免疫分析 (eFMIA)生物傳感器，具有豐富的納米間隙，可將結(jié)構(gòu)對稱的IRDye78熒光分子的近紅外熒光放大200倍以上。此外，利用M2非接觸式壓電驅(qū)動的生物打印技術(shù)（該打印技術(shù)具有分辨率高、打印速度快、高生物活性、材料浪費低等優(yōu)勢），多項性能優(yōu)于傳統(tǒng)的FIA和ELISA。eFMIA能檢測腫瘤患者隊列中sICAM-1和sPD-L1的標(biāo)志物差異水平，發(fā)現(xiàn)相較于部分緩解（PR）的病人隊列，疾病進(jìn)展（PD）隊列中存在sPD-L1高表達(dá)，sICAM-1低表達(dá)（見圖1）。

圖1:NIF增強(qiáng)等離子體微陣列檢測示意圖

作者使用德國M2-Automation公司的iTWO-200非接觸式點樣儀進(jìn)行多孔板微陣列制備，過程中使用壓電式皮升級PDMD噴頭，其具有良好的定位精度和點樣準(zhǔn)確性，設(shè)置環(huán)境濕度為60%，溫度為25℃，體積為180 pL /滴，每個點重復(fù)5次，同時，液滴的大小和飛行軌跡使用集成的頻閃儀實時進(jìn)行跟蹤。樣品點印在納米金結(jié)構(gòu)包被的孔板上，然后使用生物素標(biāo)記（IRDye78）的抗體進(jìn)行檢測，熒光強(qiáng)度使用AzureSpot軟件進(jìn)行NIFR檢測以及液滴點印穩(wěn)定性分析（見圖2）。

圖2：非接觸式PDMD噴頭在AuNIS上制備具有NIRF增強(qiáng)的可控和可重復(fù)的微陣列(A)PDMD點印過程示意圖以及利用NIRF進(jìn)行免疫檢測的工作原理 (B)不同條件下合成的Au結(jié)構(gòu)之間間隙距離的量化：SEM（掃描電子顯微鏡）、Binary（二進(jìn)制圖像）(C)各種條件下合成的AuNIS歸一化間隙分布，使用gamma分布函數(shù)對直方圖進(jìn)行擬合(D)累積分布概況。(E)非接觸式PDMD點印穩(wěn)定性評估 (n=10)，單位pl(F)噴點體積分布統(tǒng)計(G) 頭部質(zhì)控相機(jī)對點印的2 × 3陣列質(zhì)控圖(H)組內(nèi)及組間點間距統(tǒng)計(1)組內(nèi)及組間熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(n=10)。(J)字母“SYSUCC”圖案的定制化點印陣列

為了進(jìn)一步利用eFMIA檢測腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物，作者培養(yǎng)了兩種人鼻咽癌細(xì)胞系S26和C666-1，首先通過RT-qPCR對ICAM-1和編碼PD-L1的CD274 mRNA表達(dá)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在C666-1細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)均高于S26細(xì)胞。此外，ICAM-1和PD-L1在人血漿、血清以及PBS中無顯著差異。眾所周知，PD-L1在腫瘤細(xì)胞中以膜結(jié)合的形式抑制T細(xì)胞的免疫活性。為了檢測鼻咽癌細(xì)胞是否會釋放PD-L1，作者在C666-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)分泌的PD-L1，且分泌水平隨時間和C666-1細(xì)胞數(shù)量的增加而增加。從臨床角度而言，識別低豐度或微量變化的生物標(biāo)志物具有重大的臨床意義。因此，作者招募了28名接受抗PD -1 ICB治療的癌癥患者，在第一次給藥前1天采集血清進(jìn)行eFMIA測定。結(jié)果顯示，治療前血清sPD-L1水平PD患者顯著高于PR患者(0.42 vs 0.18 ng /mL)，相反，PR患者血清sICAM-1水平高于對照組PD患者 (0.92 vs. 0.60 ng /mL)（見圖3）。

圖3：檢測鼻咽癌細(xì)胞和病人血清中的可溶性ICAM-1和PD-L1(A) 檢測兩種鼻咽癌細(xì)胞系S26和C666-1中ICAM1和CD274 mRNA的表達(dá)(B)鼻咽癌細(xì)胞中ICAM-1和PD-L1在S26和C666-1細(xì)胞系中的表達(dá)水平 (C) 1.6 nM ICAM-1和2.0 nM PD-L1的NIRF信號強(qiáng)度，PD-L1在PBS、20%人血漿和20%人血清中水平均增加(D)不同C666-1細(xì)胞對應(yīng)PD-L1的分泌水平，樣本來自接受抗pd -1 ICB治療的前癌癥患者(n=28)的血清(E) PD-L1和(F) ICAM-1水平檢測，根據(jù)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)歸一化法進(jìn)行NIRF相對平均強(qiáng)度計算

研究者基于金屬熒光增強(qiáng)MEF效應(yīng)，成功制備了可用于檢測腫瘤患者外周血液樣本中生物標(biāo)志物的生物傳感器，具有高靈敏度、高穩(wěn)定性、高通量的優(yōu)勢，能同時檢測多種標(biāo)志物，且標(biāo)志物之間相互干擾小�；�于此，該傳感器有望幫助臨床醫(yī)生決策和患者分層，來預(yù)測ICB治療的療效。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115633

M2-Automation成立于2003年，總部位于德國柏林，是一家創(chuàng)新技術(shù)開發(fā)公司，專注于微量/超微量、非接觸式自動化移液和生物芯片點樣技術(shù)。儀器準(zhǔn)確性、精確性高，重復(fù)性好，全程自動化點樣，同時可根據(jù)客戶需求進(jìn)行定制。

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