大腸桿菌HMS174和BLR菌株HCP表征及純化指導數據庫構建詳解
縱觀生物制藥生產的發(fā)展歷史，從目標產物中檢測并有效去除宿主細胞蛋白(HCP)雜質一直是業(yè)內人員重點關注和深入研究的問題[1-3]。如果最終的藥品制劑中雜質含量超標，會對患者安全或產品穩(wěn)定性產生不利影響，例如，ChAdOx1 nCoV-19疫苗的強烈副作用就很可能與大量HCP雜質殘留有關[4]。為了盡量提高產品質量，減少對用藥患者的影響，加快生物制藥工藝開發(fā)，有效去除HCP雜質是至關重要的。由于裂解宿主細胞獲取表達產物時，來自宿主的雜質如HCPs、DNA、RNA和內毒素也同時被釋放，因此，必須采用多重方法逐步減少HCP的殘留，直至達到質量標準(圖1)。然而，有些HCP的結構和物理化學性質很可能與靶標蛋白非常相似，因此消除此類HCP存在巨大挑戰(zhàn)。
作為一種無偏的檢測方法，基于質譜的蛋白質組學被越來越多地應用于監(jiān)測純化過程或檢測最終藥物制品中的關鍵宿主細胞蛋白質殘留。在蛋白亞單位疫苗一類的新生生物藥的工藝開發(fā)過程中，對宿主細胞蛋白質組的深度了解非常有助于尋找更合理的工藝設計方案。
荷蘭代爾夫特理工大學生物技術系的Marcel Ottens等研究人員在Biotechnology Journal上發(fā)表了文章“Characterisation of the E. coli HMS174 and BLR host cell proteome to guide purification process development”，對兩種廣泛使用的大腸桿菌菌株BLR和HMS174的完整宿主細胞蛋白質組進行了表征，基于鑒定到的蛋白質組學數據，結合表達水平、疏水性、等電點(pI)、分子量(MW)、亞基信息、可能的翻譯后修飾(PTMs)和每種可能的基因產物的毒性等信息進一步構建了全面的宿主細胞蛋白質資源庫。其中，HCP質譜數據深度解析使用PEAKS®️ Studio完成。
圖1 HCP純化過程開發(fā)方法示意圖
菌株宿主細胞蛋白全面表征
首先基于shot gun蛋白質組學方法鑒定了BLR和HMS174菌株的全蛋白質組，并通過Matlab和其他軟件工具預測了蛋白的疏水性/pI/電荷/毒性等理化性質，構建了全面的蛋白信息資源庫。
然后，作者比較了BLR和HMS174(空載質粒)菌株之間的蛋白質組學表達譜，約80%的蛋白在兩個菌株中均被檢測到，且其蛋白相對豐度（PAI）的線性回歸結果表明，即使在不同的大腸桿菌菌株之間，HCPs的總量也是相當的（圖2A）。此外，我們比較了BLR空載質粒菌與相應抗原表達菌株之間的蛋白表達，發(fā)現約90%的蛋白在兩個樣品中是相同的，但豐度存在少許差異（圖2B），可能是與制備過程的細微差異有關，因為抗原表達菌株純化前會有一次凍融。另一個原因可能是抗原的表達會對檢測到的宿主細胞蛋白質產生一定的影響，但這種差異一般很小，因此空載質粒菌株的蛋白表達可以用于指導抗原表達菌株的純化工藝。
圖2 菌株蛋白差異比較
HCP蛋白豐度與分子量、等電點和疏水性分布
作者比較了空載質粒BLR與HMS174菌株中分別表達的“抗原1”和“抗原2”與HCPs的MW(分子量)、pI（等電點）、GRAVY（疏水性）等指標。在兩個菌株中，HCPs的分子量總體分布在2 - 250 kDa，大多數蛋白質的分子量< 50 kDa(圖3A和3D)，豐度較高的蛋白質均分布在低分子量范圍內�？乖�1的分子量為59 kDa，而抗原2的分子量小一些，為28 kDa�？梢猿醪嚼没诜肿哟笮〉姆蛛x機制，例如SEC，將抗原從分子量相差較大的HCPs中分離出來。但是在剩下的高豐度HCPs的區(qū)域，通過質量差來分離目標抗原的效果可能就不是很理想了。
HCPs的pI分布范圍為pH 3.4-12.2，其中大多數蛋白質是酸性的(圖3B和3E)。在pI為7和8之間檢測到的蛋白較少，這是因為大腸桿菌的胞內pH為7.5，降低了具有相似pI蛋白質的穩(wěn)定性。抗原1和抗原2的pI分布區(qū)間內鑒定的蛋白均較少，說明兩種抗原的pI都與HCPs有顯著不同,因此可以考慮IEX等方法進行分離。
所有蛋白的預測GRAVY值范圍為−1.526~+1.369�？乖�1的GRAVY值與大多數HCPs相差較大，因此可以使用HIC等方法基于疏水性進行分離。
圖3 HCP屬性比較
HCP疏水性與等電點
作者進一步比較了HCPs的疏水性(GRAVY)與pI，并繪制了20個豐度最高的HCPs和模型抗原的分布圖(圖4B和4D)。由于pI和GRAVY均較低，因此IEX和HIC的組合方案更加適合用于抗原1的純化�？乖�2的疏水性與其他HCPs沒有顯著差異，而pI則差異較大，因此IEX更加適合抗原2的純化。
圖4 疏水性與等電點分布
HCP凈電荷與疏水性
蛋白質的凈電荷狀態(tài)取決于溶劑或緩沖液的pI和pH值。因此，了解不同pH值下HCPs的凈電荷有助于在使用IEX時選擇最合適的條件。作者計算了pH為7.0時HCPs的凈電荷，并將它們與預測的GRAVY值進行了對比，結果如圖5所示。
BLR菌株中，抗原1帶較多的負電荷，且與其他HCPs相比具有顯著差異（圖5B），因此可以考慮使用pH =7.0的陰離子交換色譜法進行吸附-洗脫分離。HMS174中大多數高豐度的HCPs在pH= 7.0時帶負電荷，抗原2帶少量正電荷，因此可以通過陽離子交換色譜法結合低離子強度的鹽洗脫方法進行純化，或者在流動模式下使用陰離子交換色譜法分離。
圖5 蛋白電荷（pH=7）與疏水性分布
綜上，該研究對廣泛使用的大腸桿菌菌株BLR和HMS174的完整宿主細胞蛋白質組進行了全面表征，并通過整合疏水性(GRAVY)、pI和不同pH值下的預測凈電荷等理化性質，構建了全面的大腸桿菌HCP蛋白質組屬性資源庫，可用于高效的純化工藝設計，避免了較高的試錯成本和單一的基于專家知識依賴的選擇。
原文鏈接：https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.202300068
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參考文獻
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3. Vanderlaan, M., Zhu-Shimoni, J., Lin, S., Gunawan, F., Waerner, T., &Van Cott, K. E. (2018). Experience with host cell protein impurities in biopharmaceuticals. Biotechnology Progress, 34, 828–837.
4. Krutzke, L., Roesler, R., & Wiese, S. (2021). Research Square, DOI 10.21203/rs.3.rs-477964/v1.
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