用于組織工程支架血管化的微管嵌入水凝膠生物打印

摘要
血管組織工程被認(rèn)為是有前途的可行的人造組織和器官的替代方案之一。采 用各種技術(shù)制造的宏觀和微觀空心管已被廣泛研究以模擬血管。迄今為止，尺寸從 1 微米到 10 微米的仿生毛細(xì)血管的制造仍然具有挑戰(zhàn)性。在本文中 , 通過靜電紡絲來模擬毛細(xì)血管，并將芯鞘微管嵌入羧甲基纖維素/海藻酸鈉水凝膠中進(jìn)行生物打印。結(jié)果顯示打印保真度得到改善并促進(jìn)細(xì)胞附著。 管濃度和管長(zhǎng)度對(duì)細(xì)絲尺寸和合并面積都有顯著影響。具有較高微管濃度的 打印組表現(xiàn)出較高的微管密度，燈絲/噴嘴尺寸比以及打印/設(shè)計(jì)的網(wǎng)格面積 比接近100%。在體外實(shí)驗(yàn)中，微管不僅與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相容，而且還提 供了微地形線索， 以促進(jìn)三維空間中的細(xì)胞增殖和形態(tài)發(fā)生�？傊�，我們小 組制造的微管具有用于血管化軟組織支架生物打印的潛力。

關(guān)鍵詞
生物打印，芯鞘靜電紡絲，水凝膠，微管，血管組織工程

1 引言
心血管疾�。–VD）是全球死亡的主要原因（世界衛(wèi)生組織，2022    ) 。盡管自體血管移植被認(rèn)為是臨床治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)的移植方  法受到供體數(shù)量的限制，可能會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性血管阻塞(Kucukgul et al. , 2015; Pashneh-Tala et al., 2016)。血管組織工程的發(fā)展為心血管 疾病帶來了新的治療方向。通過用合成移植物替換殘疾血管，可以重  建血管系統(tǒng)，并可以繞過閉塞和動(dòng)脈瘤（Song et al., 2018）。大直 徑（>8mm）和中直徑（6-8mm）的合成移植物主要通過成型和生物 打印來模擬血管網(wǎng)絡(luò)來制造（Fazal et al., 2021）。然而，傳統(tǒng)的制 造方法通常無法制造尺寸為亞10微米級(jí)別的毛細(xì)管擬態(tài)和生物相容性 微血管系統(tǒng)。

近年來引入靜電紡絲來制造毛細(xì)血管（Zhou et al., 2018）。通過 向液滴施加高電壓，靜電斥力抵消表面張力并拉伸液滴。一旦排斥 力克服了表面張力，泰勒錐就會(huì)形成并導(dǎo)致噴發(fā)（Kong et al.,2010）。借助靜電紡絲技術(shù)，可以制造微米到納米級(jí)的纖維。在  我們之前的研究中，開發(fā)了芯鞘靜電紡絲以獲得模擬毛細(xì)血管的管  狀結(jié)構(gòu)（Zhou & Tan ，2020a）。將兩種靜電紡絲溶液同時(shí)泵入  芯鞘噴絲頭，隨后芯溶液溶解（Zhou et al., 2021）。在另一個(gè)例 子中，吳等人。 (2020) 使用芯鞘靜電紡絲來制造聚乳酸-乙醇酸  共聚物和聚乳酸的混合纖維， 以促進(jìn)機(jī)械完整性、細(xì)胞附著和增殖  。盡管越來越多的研究致力于推進(jìn)靜電紡絲在血管組織工程中的應(yīng)  用，但由于靜電紡絲的固有性質(zhì)，許多工作都集中在沒有宏觀形態(tài)  控制的二維（2D）支架的制造上。為了解決這個(gè)問題，最新的研究 一直集中在增材制造技術(shù)上，例如用于制造人造血管的生物打印。

生物打印通常用于打印合成軟組織并為細(xì)胞生長(zhǎng)提供細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境 （Huang et al., 2021）。人們已經(jīng)做出了許多努力來使用生物打印 技術(shù)來制造血管模擬物，該技術(shù)可以提供均勻的細(xì)胞負(fù)載生物墨水。 例如，徐等人。（2018）利用雙層圓形支撐支架和生物打印的小直 徑血管替代品。弗里曼等人。(2019) 將纖維蛋白原與明膠混合，在 旋轉(zhuǎn)收集器上打印血管結(jié)構(gòu)。關(guān)于生物打印材料，海藻酸鈉（SA） 由 于其生物相容性、生物可降解性以及對(duì)二價(jià)抗衡離子的快速交聯(lián)反應(yīng) , 是細(xì)胞培養(yǎng)中使用最廣泛的生物打印材料之一（Asadi et al.,2020）。另一方面， 由于其流體特性，純 SA 溶液的打印通常會(huì)導(dǎo)  致打印保真度和結(jié)構(gòu)完整性較差。此外，細(xì)胞親和力的缺乏導(dǎo)致細(xì)胞 附著和增殖低。為了解決這些問題，研究人員將SA與其他生物材料混 合，例如凝膠（Mondal等，2019）、膠原蛋白（Yang等，2018）和羧甲基纖維素（CMC）（Zhang等，2021）， 以改善機(jī)械性能特  性并最大限度地減少生物惰性（Sun & Tan ，2013）。此外，靜電紡 絲與生物打印的結(jié)合在血管組織工程中顯示出日益增長(zhǎng)的趨勢(shì)。例如  , 金等人。 (2022) 在電紡微纖維上生物打印復(fù)合生物墨水， 以實(shí)現(xiàn) 更好的細(xì)胞粘附。在生物墨水中添加電紡纖維是為印刷組織提供內(nèi)部  支撐的另一種方法。趙等人。 (2020) 將分散纖維與 CaP 粉末混合用于3D 打印，Chen 等人。 (2020)將纖維與軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)混合  來制造軟骨組織支架。所有研究均表現(xiàn)出高印刷適性和良好的生物相  容性。然而，纖維在收集器表面隨機(jī)靜電紡絲，導(dǎo)致微纖維分布不均  勻。此外，水凝膠中的纖維混合物顯示生物墨水中缺乏微管結(jié)構(gòu)。

在這項(xiàng)研究中，靜電紡絲和生物打印技術(shù)相結(jié)合來制造用于生物打印的管裝水凝膠。本研究的目的是研究靜電紡絲微管對(duì)復(fù)合支架打印  保真度和生物相容性的影響。假設(shè)是 (1) 在生物打印水凝膠中包含微 管將改善或至少保持可打印性和打印保真度， (2) 嵌入的微管將促進(jìn)  3D 結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞粘附和活力。為了檢驗(yàn)假設(shè)，選擇了水凝膠內(nèi)微管濃 度的三個(gè)水平和平均微管長(zhǎng)度的三個(gè)水平。結(jié)果表明，添加縮短的微  管顯著提高了打印保真度和細(xì)胞附著。這項(xiàng)研究有可能為組織工程應(yīng)  用中亞 10 微米尺度的人工毛細(xì)血管化支架制造的進(jìn)步貢獻(xiàn)知識(shí)。

2 材料和方法
2.1 靜電紡絲溶液配制
聚乙二醇（PEO，分子量=100,000）粉末和SA粉末購自Sigma- Aldrich。聚苯乙烯（PS，分子量 = 260,000）顆粒來自 AcrosOrganics 。 CMC 粉末獲自MP Biomedicals。二氯甲烷 (DCM) 購  自 Marron Fine Chemicals。去離子水（DI 水）取自 Millipore Milli -Q 系統(tǒng)。食品級(jí)染料購自 Chefmaster。

通過將17%wt/vol PS（鞘液）和12%wt/vol PEO（芯液）分別 溶解在DCM中，在室溫下磁力攪拌4小時(shí)來制備靜電紡絲溶液。首先 將帶有電紡微管的墊子浸入去離子水中 12 小時(shí)以溶解 PEO 核。然  后將干燥的墊切成 5mm×5mm 的塊，并通過超聲波振動(dòng)（Fisherband Model 50 聲波粉碎機(jī)）在 20 kHz 和 100% 聲波強(qiáng)度下破碎 1 和 2 分鐘。通過在掃描電子顯微鏡（SEM） 圖像中隨機(jī)選擇20個(gè) 微管并手動(dòng)測(cè)量微管壁與端部之間的距離來測(cè)量微管直徑和長(zhǎng)度�；�  于管濃度（wt/vol%）和微管長(zhǎng)度(μm）的五組被設(shè)置為對(duì)照（無微 管）、0.05%長(zhǎng)（長(zhǎng)長(zhǎng)度為0.05% PS微管）、0.05%短（短為0.05  % PS微管）長(zhǎng)度），長(zhǎng) 0.1%，短0.1%。在每次超聲振動(dòng)中，稱重  12.5mg 微管并分散在 10ml 70% wt/vol 乙醇中。室溫風(fēng)干后，將 3% wt/vol CMC 和 1% wt/vol SA 與破碎的微管溶解在去離子水中 , 通過磁力攪拌 72 小時(shí)制成生物打印溶液。

2.3  生物打印
生物打印過程在BIO X生物打印機(jī)（Cellink）上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)流程如圖1 所示。

FIGURE 1 實(shí)驗(yàn)過程示意圖。 CMC，羧甲基纖維素；PEO、聚乙二醇； PS、聚苯乙烯； SA ，海藻酸鈉。

生物墨水用食品級(jí)染料染成不同顏色。復(fù)合生物墨水是從連接到噴  嘴直徑為 0.41 毫米的空氣壓縮機(jī)的 3 毫升注射器中擠出的。對(duì)于  所有五組，擠壓壓力均為 20 kPa，掃描速度設(shè)置為 10 mm/s。每 組選擇三個(gè)重復(fù)。為了測(cè)量不同組的細(xì)絲尺寸和合并面積， 以 10%  填充密度和 0.41 mm 層高打印 20 × 20 × 1mm 網(wǎng)格（圖 2a 、b ) 。隨機(jī)選擇20根細(xì)絲進(jìn)行尺寸測(cè)量，并取10個(gè)樣品進(jìn)行合并面積 測(cè)量。
 

FIGURE 2 (a)長(zhǎng)絲尺寸測(cè)量。 (b)合并面積測(cè)量。 (c)微管對(duì)準(zhǔn)分析。 （d1-d3）微管密度分析：（d1）原始圖像（d2）灰度圖像（d3）閾值二值圖像（比例尺= 1毫米）

為了測(cè)量打印結(jié)構(gòu)內(nèi)的微管密度，在培養(yǎng)皿上為每組打印另一個(gè) 20  × 20 × 0.5 mm 的單層，填充密度為 10%，層高為 0.12 mm。每組 采集十個(gè)樣品進(jìn)行密度分析。所有樣品均使用 EVOS XL Core 光學(xué)顯 微鏡 (Thermo Fisher Scientific Inc.) 進(jìn)行觀察，并通過 ImageJ (LOCI) 進(jìn)行分析。進(jìn)行方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分別以微 管濃度和超聲處理時(shí)間為變量， 以微管密度為響應(yīng)變量。通過統(tǒng)計(jì)分 析軟件（北卡羅來納州立大學(xué)）計(jì)算p值來證明假設(shè)。將圖像轉(zhuǎn)換為  16 位以進(jìn)行像素分析（圖 2d）都需要微管密度和對(duì)齊分析。一些微 管包括珠子形成。密度分析通過調(diào)整圖像的灰度閾值來識(shí)別微管，并 計(jì)算暗區(qū)的比例以獲得微管密度。

比對(duì)分析是通過OrientaionJ軟件包進(jìn)行的，該軟件包是ImageJ中的  插件之一。通過評(píng)估局部鄰域內(nèi)的梯度結(jié)構(gòu)張量，可以表達(dá)圖像的方  向和各向同性性質(zhì)。在本研究中，我們將局部鄰域的標(biāo)準(zhǔn)差設(shè)置為2    個(gè)像素，并通過三次樣條方法計(jì)算梯度。結(jié)果繪制了從-90°到90°不  同程度的微管取向分布。如圖2c所示，0度代表水平微管，90度代表 垂直微管。 0 度的高取向分布意味著大多數(shù)微管是水平的并且具有與 生物打印方向相同的方向。 Y 軸表示圖像處理中對(duì)齊分析檢測(cè)到的像 素?cái)?shù)。

2.4 SEM
將五組水凝膠在攪拌熱板（Thermo Fisher Scientific）上于 65°C 加熱一小時(shí)。水凝膠充分干燥后，用濺射鍍膜機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行鍍膜1分鐘。使用場(chǎng)發(fā)射SEM（Zeiss的Supra 55 VP） 以15 kV電子高壓在 ×245放大倍數(shù)下拍攝SEM圖像。

2.5 流變測(cè)試
流變學(xué)和粘度測(cè)量由 TA Instruments Discovery HR 30 流變儀(Waters) 進(jìn)行。通過在固定 1.0% 應(yīng)變下將角頻率從 0.1 改變到100.0 rad/s 來測(cè)量水凝膠的儲(chǔ)能模量和損耗模量。通過改變 1 至  100 1/s 的流量掃描來研究剪切應(yīng)力和粘度。兩個(gè)程序的溫度均保持 在 25°C，浸泡時(shí)間為 180.0 秒。

2.6 膨脹測(cè)試
將五組（10 mm×10 mm×10 mm ）的微管嵌入水凝膠立方體交聯(lián)并 浸入3 mL 20% CaCl2 溶液中。交聯(lián) 24 小時(shí)后，將立方體從 3D   打印模具中取出， 以確保立方體完全交聯(lián)。然后將立方體浸入去離子 水中，每 12 小時(shí)稱重一次，通過公式（1）計(jì)算其膨脹率。初始重  量（W0）為24小時(shí)時(shí)的重量，36小時(shí)、48小時(shí)、 96小時(shí)時(shí) 的重量為濕重（Wt）

2.7 滲透性測(cè)試
將五個(gè)圓盤（30 mm×30mm×3mm）成型并在20％CaCl2溶液中   交聯(lián)24小時(shí)，共五組。然后將圓盤浸入食品級(jí)染料中，液位與圓盤高度相匹配。滲透率可以從染色區(qū)域觀察，滲透率可以通過以下公式計(jì) 算：

2.8 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)
通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 8 測(cè)定 (CCK-8) 評(píng)估 PS 微管對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞系（HUVEC，源自 Angio-Protomie）的細(xì)胞毒性。將微管用70% 乙醇滅菌 30 分鐘，然后用杜爾貝科磷酸鹽緩沖鹽水 (DPBS)沖洗兩次。將細(xì)胞以 1 × 105 個(gè)細(xì)胞/cm2 接種在 96 孔培養(yǎng)板中  , 并在 37°C 、5% CO2 Thermo Scientific Forma 系列 3）下于  200 μL  內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基 [EGM]-2） 中孵育水 套 CO2 培養(yǎng)箱）。孵育 24 小時(shí)后，用 DPBS 沖洗細(xì)胞，并將細(xì)胞 暴露于含有 200 μL 培養(yǎng)基的 3 mg PS 微管中。僅含有培養(yǎng)基中的  HUVEC 的孔作為陰性對(duì)照，僅含有 EGM-2 的孔作為空白。孵育 48  小時(shí)后，除去用過的培養(yǎng)基，并向每孔中添加 10:1 EGM-2/CCK-8   溶液，孵育 4 小時(shí)。 4小時(shí)后，觀察顏色變化，并將每孔100μL溶液 轉(zhuǎn)移至新的96孔板中。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)井，都制作了技術(shù)復(fù)制品。使用 酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量樣品的吸光度。根據(jù)以下等式，細(xì)胞活力以百分比表示：

其中 OD 代表光密度。

2.9 細(xì)胞附著
紅色熒光蛋白 (RFP) 標(biāo)記的 HUVEC 購自 Angio-Protomie。將細(xì)胞  以 5000 個(gè)細(xì)胞/cm2 的密度接種到 T-25 培養(yǎng)瓶中，并在 EGM-2  （SinglQuot Kit） 中生長(zhǎng)直至 80% 匯合。為了獲得更好的超聲振動(dòng) 性能，選擇17％PS微管，在10mL 70％乙醇中超聲振動(dòng)2min。在生  物安全柜中蒸發(fā)乙醇24小時(shí)后，將微管與培養(yǎng)基混合均勻。使用 0.    25% 胰蛋白酶分離 RFP-HUVEC 細(xì)胞 1 分鐘，并通過以 220 rpm    離心 5 分鐘收集。細(xì)胞懸液的最終密度為9.45×105細(xì)胞/mL。首先 將 200 μL 微管懸浮液沉積在 24 孔板上以提供 3D 結(jié)構(gòu)，然后用移 液器將 150 μL 細(xì)胞懸浮液接種到微管上。將板放入培養(yǎng)箱中保存 4  小時(shí)，使細(xì)胞附著在微管上，然后向每孔中添加 200 μL 培養(yǎng)基。每 2 天更換總共 200 μL 培養(yǎng)基， 以最大程度地減少培養(yǎng)基更換過 程中微管的損失。

3 結(jié)論
3.1 微管斷裂
如圖 3 所示，選擇 5 個(gè)超聲處理時(shí)間（0.5 、1 、1.5 、2 和 2.5 分  鐘）進(jìn)行微管切割。隨著時(shí)間的推移，27% PS 微管和 17% PS 微管 的管長(zhǎng)度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。盡管 27% PS 微管的平均直徑 (3.50 µm )  比 17% PS 微管 (2.08 µm) 更大，但較高的濃度使得泵送溶液進(jìn)  行靜電紡絲變得困難。在這種情況下，采用超聲處理時(shí)間為 1 和 2分鐘的 17% PS 微管進(jìn)行進(jìn)一步研究。超聲振動(dòng)1分鐘和2分鐘的平 均管長(zhǎng)分別為397.16和145.42μm。

3.2 打印保真度和微管密度

FIGURE 3(a) Boxplot of 17% PS microtube length in different sonication time. (b) Boxplot of 27% PS microtube length in different sonication time (PS, polystyrene).

為了觀察細(xì)絲和合并區(qū)域，將五組打印成20×20mm的網(wǎng)格（圖4a） 。根據(jù)管濃度（wt/vol%）和微管長(zhǎng)度(μm）設(shè)置五組作為對(duì)照（無 微管）、0.05%長(zhǎng)（長(zhǎng)長(zhǎng)度為0.05% PS微管）、0.05%短（短長(zhǎng)度  為0.05% PS微管） ，0.1% 多頭，0.1% 空頭。所有五組均成功打印 出網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。方差分析測(cè)試還證明，微管的存在對(duì)細(xì)絲尺寸有顯著影  響（p <0.0001）。微管濃度和長(zhǎng)度均顯著影響細(xì)絲尺寸，分別為 p  <0.0001 和 p =0.0215。網(wǎng)格合并區(qū)域的分析（圖 5b）表明，具有較長(zhǎng)微管或較高微管濃 度的組均對(duì)打印保真度具有顯著影響，分別為 p <0.0001 和 p =0.    0003。通過比較對(duì)照組和其他組的合并區(qū)域，我們可以看到微管通  過使印刷/設(shè)計(jì)比率接近 100% 來提高印刷保真度。
 

FIGURE 6    Storage modulus and loss modulus of different hydrogels.

長(zhǎng)和 0.1% 短的組，當(dāng)角頻率約為 60-70 rad/s 時(shí)，Gʹ 與 Gʹʹ 交叉  , 這表明這些水凝膠在高角頻率下更像固體。對(duì)于對(duì)照組和 0.05%    的短路，Gʹʹ  比 Gʹ 大 100 rad/s，并且更像液體的狀態(tài)導(dǎo)致打印網(wǎng)格 的保真度降低。

剪切應(yīng)力-剪切速率曲線（圖7a）顯示剪切稀化特性，這表明隨著 剪切速率的增加，非牛頓流體的粘度降低（圖7b）。與其他三組相比, 0.05%長(zhǎng)和0.1%短的組具有最高的剪切應(yīng)力和粘度，表明在生物打 印過程中具有更好的打印性能。這表明復(fù)合水凝膠具有良好的流變性  能，適合生物打印。

3.4 溶脹及滲透性測(cè)試
斷裂。表明在合理的時(shí)間范圍內(nèi)具有良好的生物降解性。 0.1%短組 的腫脹率最大，對(duì)照組大部分時(shí)間腫脹率最小。表明具有微管的基團(tuán) 可以提供水滲透的通道。

滲透率分析在 7 天的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。如圖 9b 所示，7 天后所有五 組均顯示滲透面積增加。對(duì)照組的通透性高于其他組。對(duì)于4個(gè)微管  組，0.05%長(zhǎng)組的滲透性高于其他組，0.1%長(zhǎng)組的滲透性最小。

隨著時(shí)間的增加，樣品的腫脹率呈增加趨勢(shì)，如圖8所示。所有五組  均在前48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)最急劇的增加。 96小時(shí)時(shí)，在樣品表面觀察到斷裂。表明在合理的時(shí)間范圍內(nèi)具有良好的生物降解性。 0.1%短組 的腫脹率最大，對(duì)照組大部分時(shí)間腫脹率最小。表明具有微管的基團(tuán) 可以提供水滲透的通道。

滲透率分析在 7 天的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。如圖 9b 所示，7 天后所有五 組均顯示滲透面積增加。對(duì)照組的通透性高于其他組。對(duì)于4個(gè)微管  組，0.05%長(zhǎng)組的滲透性高于其他組，0.1%長(zhǎng)組的滲透性最小。
 

FIGURE 7 (a) Shear stress-shear rate curve,
(b) viscosity-shear rate curve.

FIGURE 8  (a) Swelling rate test of Day 0 (scale bar = 2 cm). 
(b) Swelling rate of hydrogel.
 

FIGURE 9 (a) Permeability test of Day 0 and 7 (scale bar = 5cm). 
(b) Permeability of hydrogels.

FIGURE10 (a) RFP images for cell attachment from Day 0 to 11.
(b) Overlay images for cell attachment from Day 4 to 11 (scale bar = 300 µm).
(c) Biocompatibility results of PS microtubes. PS, polystyrene; RFP, red fluorescent protein.

3.5 生物相容性和細(xì)胞附著測(cè)試
PS微管的生物相容性測(cè)定結(jié)果如圖10c所示。盡管與僅使用 HUVEC   相比，細(xì)胞活力下降至 87.31%，但活力的雙樣本 t 檢驗(yàn)的 p 值為  0.2184，大于 0.05。這表明 PS 微管不會(huì)顯著影響細(xì)胞活力，并且 與測(cè)試的細(xì)胞具有生物相容性。

生物相容性測(cè)試后進(jìn)行細(xì)胞貼壁。通過將微管分散并混合在介質(zhì) 中，使微管懸浮在介質(zhì)中并形成三維結(jié)構(gòu)。細(xì)胞附著的光學(xué)顯微鏡圖 像如圖10所示。孵育4小時(shí)后，細(xì)胞開始附著到微管上。這種初步的 細(xì)胞培養(yǎng)表明，微管為 HUVEC 細(xì)胞提供了附著，它們可用于潛在的 毛細(xì)管支架。

4 討論
在本文中，我們將靜電紡絲微管與 CMC/SA 水凝膠結(jié)合起來，用于  生物打印支架的血管化。這項(xiàng)研究不同于傳統(tǒng)的混合生物打印，即在 生物打印結(jié)構(gòu)的每一層中插入靜電紡絲墊（Naghieh 等人，2017 年 ; Vyas 等人，2020 年）。微管通過超聲波振動(dòng)破碎并均勻分散在  復(fù)合生物墨水中。該方法顯示了制造過程的簡(jiǎn)單性、支架孔隙率的均 勻性以及支架的多向血管化潛力。

水凝膠本質(zhì)上是粘彈性的，可以通過改變聚合物或交聯(lián)劑濃度來 調(diào)節(jié)材料的粘彈性（Mattei et al., 2017）。當(dāng)一個(gè)聚合物鏈與另一 個(gè)聚合物鏈連接并形成更大的鏈或網(wǎng)時(shí)，就會(huì)發(fā)生交聯(lián)過程（Lopez   Hernandez 等人，2021 ）。較長(zhǎng)的聚合物鏈纏結(jié)并增加溶液粘度。

在未交聯(lián)的水凝膠中添加微管將增加水凝膠的整體密度和粘度。從噴  嘴擠出時(shí)，一些微管會(huì)相互纏結(jié)，因此有助于保持水凝膠的形狀保真  度。生物打印過程結(jié)束后，微管-水凝膠界面的剪切應(yīng)力會(huì)將水凝膠保 持在一起，這減少了未交聯(lián)水凝膠的液體流動(dòng)效應(yīng)， 同時(shí)仍然適合擠  出�？紤]到微管與水凝膠相比是固體，水凝膠中較高的微管密度將導(dǎo)  致在相同的時(shí)間和打印壓力下擠出更少的水凝膠，與3D模型相比減少 了過量的水凝膠擠出。

作為非牛頓液體，復(fù)合CMC/SA水凝膠從噴嘴擠出后會(huì)延伸，導(dǎo)  致細(xì)絲尺寸大于噴嘴尺寸。隨著微管混合在復(fù)合水凝膠中，復(fù)合生物  墨水的整體粘度增加，轉(zhuǎn)變?yōu)楦�固體的狀態(tài)。圖 5 顯示，微管濃度和 長(zhǎng)度對(duì)打印結(jié)構(gòu)中的細(xì)絲尺寸、合并面積和微管密度有顯著影響。更  高的濃度和更短的微管可以更好地與復(fù)合水凝膠結(jié)合，最大限度地提  高其對(duì)生物墨水流變特性的影響。與 0.05% 短的組相比，0.05% 長(zhǎng) 的組顯示出接近 100% 的比率，表明微管濃度和長(zhǎng)度之間存在交互作 用。

然而，濃度較低和微管較短（短0.05%）的組在五組中表現(xiàn)出最低的 網(wǎng)格面積比。這表明微管長(zhǎng)度和濃度對(duì)細(xì)絲合并具有交互影響。一種 可能的解釋可能是由于復(fù)合生物墨水的擠出量較高，導(dǎo)致合并面積增 加。圖 5c 顯示，較高的濃度和較短的微管會(huì)導(dǎo)致打印結(jié)構(gòu)中微管密 度的增加，其中 0.05% 短組顯示密度最低。人們認(rèn)為，微管濃度比 微管長(zhǎng)度起著更重要的作用，并且較短的微管濃度越高，印刷結(jié)構(gòu)中 的微管密度就越高。

流變特性解釋了水凝膠生物打印過程的本質(zhì)。較高的儲(chǔ)能模量 (Gʹ ) 表明水凝膠需要更大的能量來扭曲樣品結(jié)構(gòu)，較高的損耗模量 (Gʹʹ)   表明水凝膠具有存儲(chǔ)更多能量的能力 (Zin et al., 2019)。在圖 6 中  , 對(duì)照組和 0.05% 短組的 Gʹʹ 高于 Gʹ , 表明其行為更像液體。 0.05 %長(zhǎng)和0.1%短的組具有更高的Gʹ 、Gʹʹ、剪切應(yīng)力和粘度，表明比其他  組更好的印刷保真度。 0.05% 長(zhǎng)、0.1% 長(zhǎng)和 0.1% 短組在較高角頻 率（大約 60-70 rad/s）下轉(zhuǎn)變?yōu)楦�接近固體的狀態(tài)。我們還可以看 到，隨著微管濃度和長(zhǎng)度的增加，隨著角頻率的增加，水凝膠的液體  到固體的轉(zhuǎn)變發(fā)生得更早。圖 5a 證實(shí)了與對(duì)照組相比，這兩組的燈  絲尺寸和網(wǎng)格面積有所改善。然而，剪切稀化特性表明，3% CMC/1  % SA 的復(fù)合水凝膠可能不是理想的生物打印材料，盡管具有增加水  凝膠粘度的好處。

微管的添加對(duì)復(fù)合生物墨水的膨脹和滲透性能有顯著影響。在圖  8中，在96小時(shí)內(nèi)，與對(duì)照組相比，所有微管組都表現(xiàn)出更高的膨脹  率，其中0.1%短組顯示出明顯更高的膨脹率，這可能是由于較短的微 管提供的微通道增加，促進(jìn)了流體流動(dòng)和膨脹的增強(qiáng)。在圖 9 中，所 有組都表現(xiàn)出良好的滲透性，使它們成為未來細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用的有希望  的候選者。然而，與對(duì)照組相比，所有微管組均表現(xiàn)出較低的滲透性  , 并且更長(zhǎng)和更高濃度的微管對(duì)降低滲透性的影響更顯著。在這兩個(gè)  參數(shù)中，微管濃度似乎對(duì)滲透性的降低起著更重要的作用。這表明固  態(tài)微管可能會(huì)通過阻塞高微管密度和長(zhǎng)度的滲透通道而對(duì)支架產(chǎn)生不  利影響。因此，在未來的細(xì)胞培養(yǎng)中，最小化微管長(zhǎng)度并優(yōu)化水凝膠  支架中的微管密度非常重要。

體外實(shí)驗(yàn)表明電紡PS微管與HUVEC細(xì)胞具有生物相容性。培養(yǎng)基 中分散的微管被懸浮，并在 3D 空間中提供了更大的空間和高體積重 量比， 以實(shí)現(xiàn)更好的細(xì)胞附著和增殖。如圖 10a 所示，4 小時(shí)后，HUVEC 細(xì)胞從圓形變?yōu)闂l形，并在 3D 空間中跨越不同的微管。幾 天后，一些細(xì)胞成功地?cái)U(kuò)展到多個(gè)微管， 同時(shí)與其他細(xì)胞建立了通訊 。結(jié)果表明PS微管具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的潛力。

5 結(jié)論
簡(jiǎn)而言之，本研究研究了同軸靜電紡絲微管在毛細(xì)血管化復(fù)合生物打  印過程中的潛力。通過打印水凝膠中均勻分散的微管以及可調(diào)節(jié)的微  管長(zhǎng)度和濃度，我們的團(tuán)隊(duì)能夠制造具有微尺度通道和可控宏觀幾何  形狀的混合仿生血管化支架。我們的結(jié)果表明，靜電紡絲微管的添加  對(duì)打印絲尺寸和打印保真度有顯著影響。此外，水凝膠中的微管濃度  影響印刷水凝膠內(nèi)的微管密度。在五個(gè)組中，0.1%長(zhǎng)的組具有較高的 微管濃度和較長(zhǎng)的長(zhǎng)度，顯示出最好的生物打印結(jié)果。此外，0.1%短 組的膨脹率最高，對(duì)照組的滲透性最好。 PS 微管與 HUVEC 細(xì)胞兼  容，具有毛細(xì)血管化的潛力。未來的工作將集中于交聯(lián)水凝膠細(xì)胞培  養(yǎng)和生物打印過程中微管運(yùn)動(dòng)的模擬。還將研究與 5-10μm 的天然人 體毛細(xì)血管尺寸一致的更大微管的制造。