naica®微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)定量DNA標(biāo)準(zhǔn)品在弧菌NGS檢測(cè)的應(yīng)用

導(dǎo)讀
   
弧菌是一種普遍存在的革蘭氏陰性菌屬，廣泛存在于溫帶水生和海洋環(huán)境中，隨著水溫升高，給人類健康帶來新的問題，弧菌由100多種弧菌屬組成，其中12種可致人類感染，其中霍亂弧菌最為常見，可引起嚴(yán)重腹瀉病，其他兩種常見的非霍亂弧菌是副溶血性弧菌和創(chuàng)傷弧菌，與弧菌病有關(guān)，例如傷口感染、敗血癥和胃腸炎，主要通過接觸受污染的水和食用受污染的海產(chǎn)品（主要是牡蠣）傳人�；【�的表征與檢測(cè)正在從基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)向新方法的應(yīng)用，如定量PCR，數(shù)字PCR，NGS等。瑞士科學(xué)家發(fā)表于BMC Genomics的文章“Vibrio-Sequins - dPCR-traceable DNA standards for quantitative genomics of Vibrio spp”建立Vibrio-Sequins的DNA標(biāo)準(zhǔn)使用數(shù)字PCR（dPCR）進(jìn)行絕對(duì)定量，再通過DNA標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)弧菌屬進(jìn)行NGS測(cè)序定量分析，降低文庫(kù)制備和測(cè)序的技術(shù)偏差。
 
應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶  開發(fā)六種DNA標(biāo)準(zhǔn)品，命名為Vibrio-Sequins ，同時(shí)配套優(yōu)化的 TaqMan檢測(cè)方法，用于dPCR方法進(jìn)行DNA文庫(kù)絕對(duì)定量拷貝數(shù)濃度（cp/μL）的檢測(cè)。定量限LOQ 范圍：20-120 cp/μL，檢測(cè)限LOD均為 ~ 10 cp/μL。
 
▶  數(shù)字PCR作為更精準(zhǔn)的方法，用于驗(yàn)證NGS定量方法的準(zhǔn)確性。
 
▶ 通過DNA標(biāo)準(zhǔn)品將NGS和dPCR兩種技術(shù)串聯(lián)應(yīng)用，提高基于NGS測(cè)序定量分析的精密度和準(zhǔn)確度。
  
研究成果：
   
（A）三種用于定量弧菌DNA基質(zhì)中Vibrio-Sequins的雙鏈dPCR 方法（HC1-LC1、rplA-xni、ushA-valS）拷貝數(shù)濃度對(duì)數(shù)的線性擬合分析。
 
（B）用于定量弧菌DNA 基質(zhì)中Vibrio-Sequins的三種 dPCR 方法（HC1-LC1、rplA-xni、ushA-valS）的未轉(zhuǎn)化的線性關(guān)系。斜率表示標(biāo)準(zhǔn)品的Qubit和dPCR 測(cè)量值之間的差異。
 
（A-B）測(cè)量相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的PCR擴(kuò)增子的拷貝數(shù)范圍為3–50000 cp/μL。數(shù)據(jù)表示擴(kuò)展測(cè)量不確定度（±MU）的平均值 （n = 10; nruns= 3）。
 
（C）Vibrio-Sequins標(biāo)準(zhǔn)品的dPCR方法驗(yàn)證的相關(guān)結(jié)果。顯示的數(shù)據(jù)是三次dPCR實(shí)驗(yàn)總體平均拷貝數(shù)濃度（cp/μL）和總體CV值（%），重復(fù)性（%），批間重復(fù)性（%），標(biāo)準(zhǔn)不確定度（%），以及k=2的MU不確定度。
   （A） 散點(diǎn)圖顯示單DNA文庫(kù)中Vibrio-Sequins標(biāo)準(zhǔn)品的預(yù)期拷貝數(shù)濃度 （cp/μL）與測(cè)量拷貝數(shù)濃度 （cp/μL） 的線性關(guān)系。預(yù)期拷貝數(shù)濃度是指在對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)后為每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算的拷貝數(shù)濃度，基于Vibrio-Sequins的dPCR定量結(jié)果。測(cè)得拷貝數(shù)濃度是指樣品經(jīng)過文庫(kù)制備后dPCR測(cè)得的拷貝數(shù)濃度。圖中顯示了Vibrio-Sequins混合物（1 = 圓形和 2 = 正方形）的六種標(biāo)準(zhǔn)品 HC1（紫黑色）、LC1（深藍(lán)色）、rplA（青藍(lán)色）、ushA（綠色）、valS（淺綠色）和 xni（黃色）中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的單個(gè)重復(fù)的拷貝數(shù) （cp/μL）（1 = 圓形），以及變異系數(shù)（黑色）±變異系數(shù) （%CV; n = 10）。
（B） DNA 文庫(kù)中Vibrio-Sequins測(cè)序定量的準(zhǔn)確性。散點(diǎn)圖顯示了Vibrio-Sequins中（1 = 圓形和 2 = 正方形）六種標(biāo)準(zhǔn)品 HC1 （藍(lán)色）、LC1 （紫色）、rplA （粉紅色）、ushA （紅色）、valS （橙色） 和 xni（黃色）中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品單個(gè)重復(fù)的非歸一化覆蓋率 （1 = 圓形和 2 = 正方形） 與Vibrio-Sequins的投入濃度 （attomoles/μL）。
（C） DNA 文庫(kù) （S28-S47） 內(nèi)Vibrio-Sequins測(cè)序定量的準(zhǔn)確性。散點(diǎn)圖顯示了兩種Vibrio-Sequins（1 = 圓形和 2 = 正方形）中六種標(biāo)準(zhǔn)品 HC1（淡紫色）、LC1（紫色）、rplA （粉紅色）、ushA（紅色）、valS（橙色）和 xni（黃色）中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品單個(gè)重復(fù)的歸一化覆蓋率 （1 = 圓形和 2 = 正方形） 與Vibrio-Sequins的投入濃度 （attomoles/μL）。通過對(duì)DNA文庫(kù)中Vibrio-Sequins的最低覆蓋率進(jìn)行子采樣讀取，進(jìn)行歸一化。
（D） 三種不同的弧菌DNA混合物（A、B 和 C）由 Qubit 定量，包括來自霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌和梅茨尼科維弧菌的不同量的DNA，并以 2%的豐度加入Vibrio-Sequins混合物 1（混入 A 和 B）或Vibrio-Sequins混合物 2（混入C）。
（E） 采用 [23] 中開發(fā)的方法，使用DNA文庫(kù)（S28、S29和S38 = 弧菌混合物A-C）中Vibrio-Sequins的dPCR拷貝數(shù)濃度（cp/μL），針對(duì)三種弧菌DNA混合物（A、B 和 C）中的對(duì)弧菌來源的DNA進(jìn)行定量。
 
微生物DNA的基因組分析和定量越來越多地應(yīng)用于弧菌屬的基礎(chǔ)研究和診斷。與傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法相比，基于測(cè)序的方法的顯著優(yōu)勢(shì)是不需要任何關(guān)于樣品的前期信息。此外，可以檢測(cè)到非常少量的弧菌衍生DNA以及不可培養(yǎng)的弧菌菌株。然而，盡管（宏）基因組學(xué)具有不可或缺的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，但由于文庫(kù)制備、測(cè)序和比對(duì)過程中出現(xiàn)的技術(shù)偏差，很難對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析和樣本間比較。
 
Vibrio-Sequins可用于確定和減少誤差源和DNA文庫(kù)間的差異，也可用于在不同的文庫(kù)制備和測(cè)序方法之間、實(shí)驗(yàn)和批間以及單個(gè) DNA 文庫(kù)之間進(jìn)行歸一化，保留生物學(xué)上有意義的差異的同時(shí)，顯著減少技術(shù)變量來源的偏差。除了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化外，Vibrio-Sequins還是弧菌屬 DNA定量的重要工具。
 
作者已經(jīng)證明，通過將NGS與可量值溯源標(biāo)準(zhǔn)品的 dPCR 方法串聯(lián)，并通過使用Vibrio-Sequins標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)現(xiàn)了混合樣本中幾種弧菌 DNA 的精確定量。因此，該方法可能應(yīng)用于定量宏基因組樣品中未知數(shù)量的DNA，從而能夠檢測(cè)痕量的弧菌DNA。Vibrio-Sequins的實(shí)施以及NGS與dPCR的聯(lián)合應(yīng)用，將提高現(xiàn)有宏基因組測(cè)序方法的準(zhǔn)確性。
 
結(jié)論：
通過參考標(biāo)準(zhǔn)品將NGS和dPCR聯(lián)合應(yīng)用，提高基于NGS的定量方法的精密度和準(zhǔn)確度，為測(cè)序定量的計(jì)量可追溯性提供了途徑，為將測(cè)量科學(xué)整合到基于NGS的方法中開辟了新思路。
原文鏈接如下：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10318669/
 
 
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