Arrayjet芯片點(diǎn)樣儀助力蜱傳腦炎病毒檢測(cè)

蜱傳腦炎，是一種由蜱傳腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）引起的，經(jīng)蜱蟲傳播的傳染病，呈現(xiàn)各種神經(jīng)系統(tǒng)病癥，目前尚無(wú)特效療法。其診斷主要依賴于TBEV抗體檢測(cè)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent ascept， ELISA）和免疫熒光試驗(yàn)（immunofluorescence assay， IFA）。然而，蜱傳腦炎病毒所屬的正黃病毒屬內(nèi)有很多病毒都存在高度交叉反應(yīng)，導(dǎo)致TBEV抗體檢測(cè)的結(jié)果有偏差，例如檢測(cè)中出現(xiàn)西尼羅河病毒（ West Nile virus ，WNV）的假陽(yáng)性結(jié)果。因此急需找到一種高靈敏性和強(qiáng)特異性檢測(cè)TBEV的方法。

來(lái)自荷蘭國(guó)家公共衛(wèi)生與環(huán)境研究所傳染病控制中心的團(tuán)隊(duì)，于2024年2月在《Viruses 》上發(fā)表了這篇文章。該研究利用蛋白微陣列芯片技術(shù)，改進(jìn)了檢測(cè)TBEV的方法。

TBEV病毒所屬的正黃病毒屬，其序列相對(duì)保守，是一個(gè)含有約11000個(gè)堿基的正鏈RNA病毒，有3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：C，prM和E蛋白，以及7種非結(jié)構(gòu)蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。E蛋白包含EDI、EDII和EDIII三個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖1 ）。作者在之前的研究中，使用重組NS1（rNS1）蛋白檢測(cè)基于NS1多重蛋白微陣列中的抗正黃病毒IgG。通過(guò)多重微陣列方法，使用少量樣本體積（例如 10 μL 血清）就能快速、高通量同時(shí)檢測(cè)針對(duì)多種病毒蛋白的抗體。本文，作者進(jìn)一步優(yōu)化，在NS1抗原旁邊添加了EDIII抗原，提高了檢測(cè)TBEV IgG的靈敏度和特異性。

圖1 正黃病毒屬基因組與實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的EDIII/rNS1基因載體示意圖

1.制備蛋白微陣列芯片
將TBEV、WNV、ZIKV（寨卡病毒）、USUV（烏蘇圖病毒）、JEV（日本腦炎病毒）、EDNV（登革熱病毒）的EDIII和NS1蛋白，利用英國(guó)Arrayjet公司的Marathon系列生物芯片點(diǎn)樣儀（新型號(hào)Mercury系列）制備成蛋白微陣列芯片。

2.血清樣本與蛋白微陣列芯片雜交孵育
感染過(guò)或疑似感染過(guò)DENV、ZIKV、WNV、USUV、TBEV的患者血清，陰性血清分別與蛋白微陣列芯片雜交孵育，并用芯片掃描儀獲取雜交結(jié)果。

3.蝕斑減少中和試驗(yàn)（Plaque Reduction Neutralization Test ，PRNT）
將上述血清與病毒混合后孵育，然后加入預(yù)先形成的A549單層細(xì)胞中，觀察并計(jì)數(shù)斑塊形成情況。同時(shí)與蛋白微陣列芯片雜交結(jié)果比較。

NS1蛋白微陣列芯片結(jié)果呈現(xiàn)屬內(nèi)高度交叉反應(yīng)

在NS1的蛋白微陣列芯片雜交結(jié)果中，所有的陰性血清都無(wú)免疫特異反應(yīng)。來(lái)自感染過(guò)或疑似感染過(guò)上述病毒的患者血清雜交實(shí)驗(yàn)中，大部分血清都和相關(guān)抗原出現(xiàn)了免疫陽(yáng)性結(jié)果，而且這些患者血清同時(shí)與屬內(nèi)其他病毒出現(xiàn)了陽(yáng)性反應(yīng)，這與此前報(bào)道的正黃病毒屬內(nèi)有很多病毒都存在高度交叉相一致。

免疫學(xué)檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)--PRNT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NS1蛋白微陣列結(jié)果中出現(xiàn)的陽(yáng)性結(jié)果在PRNT中都為陽(yáng)性。在20例TBEV的患者血清實(shí)驗(yàn)中，除了蛋白微陣列芯片已經(jīng)確認(rèn)的7例之外，還有8份血清也呈現(xiàn)陽(yáng)性。說(shuō)明單獨(dú)檢測(cè)NS1抗原存在假陰性結(jié)果，因此基于NS1抗原的蛋白微陣列流程需要進(jìn)一步優(yōu)化。

TBEV EDIII的蛋白微陣列實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了提高蛋白微陣列檢測(cè)的靈敏性和特異性，使用EDIII陽(yáng)性血清（來(lái)自接種TBEV疫苗志愿者）和上述血清再次與EDIII蛋白微陣列芯片雜交。結(jié)果顯示，之前的20份TBEV患者血清 EDIII雜交結(jié)果與PRNT結(jié)果完全一致——15份血清為陽(yáng)性，5份為陰性。而這些血清樣本對(duì)WNV、DENV、ZIKV、USUV 和 JEV 的IgG反應(yīng)水平則比較低。這說(shuō)明EDIII的確存在屬內(nèi)交叉反應(yīng)，但TBEV的反應(yīng)水平則遠(yuǎn)高于其他病毒。

正黃病毒屬內(nèi)病毒在血清學(xué)檢測(cè)中的確存在高度交叉性，PRNT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論。通過(guò)在蛋白微陣列芯片中聯(lián)合使用TBEV NS1和EDIII抗原蛋白，可以提高TBEV檢測(cè)的靈敏性和特異性，有助于在感染早期快速發(fā)現(xiàn)TBEV感染，爭(zhēng)取治療的窗口期。

更多內(nèi)容請(qǐng)閱讀原文：https://doi.org/10.3390/v16020286

Arrayjet位于英國(guó)愛(ài)丁堡，專注于提供生物芯片應(yīng)用領(lǐng)域的解決方案及服務(wù)。自2000年公司成立即致力于開發(fā)新型生物樣品噴點(diǎn)方案–噴墨式液體處理平臺(tái)，該系統(tǒng)于2006年上市，目前用戶遍布全球27個(gè)國(guó)家。

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