預(yù)測和闡明3D打印癌癥細(xì)胞在水凝膠結(jié)構(gòu)中的打印后行為

區(qū)別3D生物打印與其他3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的一個關(guān)鍵特征是其對創(chuàng)建結(jié)構(gòu)的精確控制。這種特性 允許高分辨率制造具有可控結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能(如孔隙度、滲透性和剛度)的仿生結(jié)構(gòu)。然而，分析打印  后的細(xì)胞動力學(xué)并優(yōu)化其在3D制造環(huán)境中的功能只能通過反復(fù)試驗(yàn)和復(fù)制幾個實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)。這個問題 促使了細(xì)胞自動機(jī)模型的首次開發(fā)，以模擬3D生物打印結(jié)構(gòu)中的打印后細(xì)胞行為。為了改進(jìn)我們的模 型，我們使用MDA–MB–231細(xì)胞負(fù)載水凝膠生物打印了一個3D結(jié)構(gòu)，并在11天內(nèi)評估了細(xì)胞功能，包 括活力和增殖。結(jié)果表明，我們的模型成功地模擬了生物3D打印結(jié)構(gòu)，并捕獲了體外觀察結(jié)果。我們 證明了該硅模型可以預(yù)測和闡明不同初始細(xì)胞數(shù)量的生物鏈接和不同的生物鏈接配方的明膠和海藻酸 鹽打印后的生物學(xué)功能，而無需重復(fù)幾個昂貴和耗時的體外測量。我們相信這樣的計算框架將極大地 影響3D生物打印的未來應(yīng)用。我們希望這項(xiàng)研究能夠激勵研究人員進(jìn)一步認(rèn)識到如何利用硅模型來推 進(jìn)體外3D生物打印研究。

三維（3D）生物打印是新興的3D生物制造方法之一，它被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和組織工程中， 以制造復(fù)雜的模擬組織結(jié)構(gòu)1。該技術(shù)在個性化治療中具有巨大的應(yīng)用潛力，更側(cè)重于控制藥物釋放、癌癥治療藥物篩選、研究可能的副作用以及分析腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲2 。3D生物打印技術(shù)將細(xì)胞、生 物材料和受控運(yùn)動系統(tǒng)結(jié)合起來，開發(fā)復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)，并對結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能、孔隙度、滲透性和剛度 等特征進(jìn)行精確控制3 –5。該技術(shù)通過結(jié)合細(xì)胞棲息地的重要方面，可以克服傳統(tǒng)3D方法的多個限制。這些方面包括類似于腫瘤的天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的非均勻3D微環(huán)境，細(xì)胞與鄰近細(xì)胞和局部ECM 的 復(fù)雜相互作用，以及營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的復(fù)雜擴(kuò)散過程6– 8。因此，這種方法可以更好地代表細(xì)胞生長機(jī)  制的見解，并提供體內(nèi)腫瘤動力學(xué)和癌細(xì)胞對治療反應(yīng)的更緊密預(yù)測7。盡管3D生物打印技術(shù)發(fā)展迅速，但仍有一些挑戰(zhàn)需要解決。目前，生物打印技術(shù)主要是在試錯 的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)預(yù)期的輸出，增加了對實(shí)驗(yàn)技術(shù)的需求。這種反復(fù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)包括優(yōu)化生物墨水的性能 及其印刷性、結(jié)構(gòu)機(jī)械強(qiáng)度和打印期間和打印后的細(xì)胞活力9。因此，優(yōu)化生物打印相關(guān)的實(shí)驗(yàn)是非常 昂貴的。這些挑戰(zhàn)使得實(shí)驗(yàn)設(shè)計和數(shù)據(jù)收集在這個過程中變得更加復(fù)雜。


圖1所示。本研究涉及的主要步驟示意圖；步驟1：制備由明膠、海藻酸鹽和MDA-MB-231細(xì)胞系組成 的生物鏈；步驟2：打印和交聯(lián)承載細(xì)胞的3D結(jié)構(gòu)；步驟3：進(jìn)行印后體外檢測；步驟4：開發(fā)和校準(zhǔn) 一個硅模型。

本研究中提出的基于主體的模型有利于展示復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，包括細(xì)胞增殖、運(yùn)動、細(xì)胞與環(huán) 境的相互作用（例如，ECM、鄰近細(xì)胞和資源消耗）以及支架內(nèi)的細(xì)胞聚集。在這項(xiàng)研究中，我們證  明了數(shù)學(xué)模型和計算機(jī)模擬可以用來捕捉體外動力學(xué)。這種體外和芯片研究的結(jié)合可以提高研究人員 對3D生物打印結(jié)構(gòu)中細(xì)胞活動的理解，從而加速和提高優(yōu)化和實(shí)驗(yàn)設(shè)置的準(zhǔn)確性。所提出的硅模型是 非常有前途的，并能夠進(jìn)一步發(fā)展，應(yīng)用于3D細(xì)胞培養(yǎng)使用生物打印技術(shù)在不同的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

結(jié)果與討論
體外細(xì)胞研究。成功打印出腫瘤樣水凝膠網(wǎng)絡(luò)模型（圖2a）。為了確定包埋在水凝膠中的MDA-MB-  231細(xì)胞的增殖情況，采用MTT法監(jiān)測細(xì)胞在第0、4、7、10和11天的代謝活動。如圖2b所示，與第0天 相比，3D細(xì)胞/水凝膠構(gòu)建的MDA-MB-231細(xì)胞在第4、7、10和11天分別表現(xiàn)出1.86倍、2.7倍、2.78倍 和2.8倍的增殖。確實(shí)，細(xì)胞在前7天表現(xiàn)出快速增殖，從第7天到第11天幾乎保持了幾乎穩(wěn)定的細(xì)胞  增殖。有趣的是，結(jié)果表明，在3D微環(huán)境中封裝的MDA-MB-231的倍增時間比在2D培養(yǎng)中生長的細(xì)胞高 3倍，這可以歸因于3D基質(zhì)中細(xì)胞活性的降低22。從第7天到第11天，增殖細(xì)胞的數(shù)量大致保持不變，留下了一個問題:細(xì)胞是死亡還是由于不希望的條件進(jìn)入非增殖期（靜止期）。為了回答這個問題， 在11天的時間里，我們進(jìn)一步采用了活死實(shí)驗(yàn)和Ki-67免疫染色，以更好地了解包裹在3D支架中的細(xì) 胞行為生長采用活死染色法觀察MDA-MB-231 在11天內(nèi)的生存能力，結(jié)果與 MTT試驗(yàn)結(jié)果。如圖2所示，打印 后大部分細(xì)胞都能存活，第0天細(xì)胞存活率為76±2%，這清楚地表明生物打印過程對細(xì)胞活力的損害  較小。第1周存活率逐漸提高，第4天和第7天分別達(dá)到98±1%和99±1%。因此，該結(jié)構(gòu)具有足夠的多  孔性，使氧氣和葡萄糖能夠通過水凝膠支架擴(kuò)散和分布，為細(xì)胞提供適宜的生存環(huán)境。從第7天到第1 1天，雖然有部分細(xì)胞死亡，但大部分細(xì)胞存活，第11天存活率達(dá)到96±2%。通過對比活死實(shí)驗(yàn)和MTT 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以得出結(jié)論，在支架達(dá)到最大容量的7天后，有相當(dāng)一部分細(xì)胞進(jìn)入了靜息期，部分  細(xì)胞在長期靜息期開始死亡，或者是由于缺乏資源。本實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞死亡幾乎可以忽略不計，這說明 明膠/海藻酸鹽支架在生物打印中的應(yīng)用前景廣闊。

為了觀察MDA-MB-231的增殖能力，將細(xì)胞固定，并使用抗Ki-67抗體在共聚焦顯微鏡下對增殖細(xì) 胞進(jìn)行成像（圖3，4）。Ki-67是一種常用的標(biāo)記物，在細(xì)胞周期的所有活躍階段都存在，但在細(xì)胞  的固定階段則不存在23。結(jié)果表明，在第0天和第4天，ki-67的陽性細(xì)胞分別接近98±1%和95±2%，而 在第7天，這一數(shù)字下降到86±2%，然后在第11天急劇下降到約48.2±2.4。這一結(jié)果與前面的數(shù)據(jù)一 致（圖3），說明在7天內(nèi)，細(xì)胞不僅存活，而且保持了增殖能力。從第7天到第11天，盡管有很大比  例的細(xì)胞存活，但由于缺乏足夠的細(xì)胞增殖空間，它們處于靜止?fàn)顟B(tài)，無法再增殖。此外，在第7天  和第11天，細(xì)胞變得更加聚集，特別是靠近毛孔，細(xì)胞聚集中心的細(xì)胞由于被其他細(xì)胞包圍而顯示出 不增殖。因此，由于沒有足夠的空間放置子細(xì)胞，并且由于聚集體中心缺乏營養(yǎng)和氧氣，增殖過程被 中止。

將體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于參數(shù)化所建立的數(shù)學(xué)模型。

圖2 。(A)：利用生物3D打印技術(shù)制備細(xì)胞/水凝膠結(jié)構(gòu)；(B)：從第0天到第11天，MDA-MB-231在水 凝膠網(wǎng)絡(luò)中包埋的增殖。誤差條表示±SD, n≥3。

結(jié)論
到目前為止，在3D生物打印水凝膠中生長的細(xì)胞的最佳打印后行為僅通過復(fù)制幾個實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)，這些實(shí) 驗(yàn)既耗時又昂貴。為了克服這一挑戰(zhàn)，我們開發(fā)了一個CA模型來模擬3D生物打印結(jié)構(gòu)中的打印后細(xì)胞 動力學(xué)。為此，我們首先成功地打印了MDA-MB-231/明膠/海藻酸鹽生物鏈接，并在11天內(nèi)使用MTT,

Live-dead和Ki-67細(xì)胞增殖試驗(yàn)評估了細(xì)胞行為。利用體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們在CA模型中定義了3D水凝 膠網(wǎng)絡(luò)中細(xì)胞增殖、活力、運(yùn)動和簇形成的規(guī)則，并校準(zhǔn)了模型參數(shù)，如加倍時間、運(yùn)動速度和11天 內(nèi)死亡概率。我們的模型可以定量捕捉3D支架中細(xì)胞在體外打印后的行為，并能夠預(yù)測和闡明不同生 物打印條件下的細(xì)胞行為。例如，它復(fù)制了細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞向毛孔爬行的過程，然后在7天后由于營  養(yǎng)和氧氣分布不均勻而形成集群。此外，計算機(jī)數(shù)據(jù)闡明了細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞的初始數(shù)量和打印的 水凝膠網(wǎng)絡(luò)的容量，并可以根據(jù)生物墨水中細(xì)胞的初始數(shù)量預(yù)測打印后的細(xì)胞增殖。這種硅模型也可 以用含有明膠和海藻酸鹽的各種網(wǎng)絡(luò)配方來表示細(xì)胞活性。提出的數(shù)學(xué)框架可以幫助研究人員產(chǎn)生更 適合細(xì)胞生長的微環(huán)境，而無需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。因此，我們的數(shù)學(xué)框架可以被認(rèn)為是涉及生物打印相關(guān)研 究進(jìn)步的一個足智多慮的步驟。

材料與方法
材料。從加拿大Sigma-Aldrich公司獲得了褐藻酸鈉鹽、二甲亞砜 (DMSO)、氯化鈉、氯化鈣(CaCl2) 和牛皮明膠(B型)。對于細(xì)胞培養(yǎng)研究，MDA-MB-231購自ATCC, DMEM (Dulbecco ‘s Modified Eagle Medium)、FBS(胎牛血清)、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶/EDTA溶液0.25% (w /v)和磷酸緩沖鹽水(PBS) 片購自Wisent Bioproducts 。 (3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基- 2h -溴化四氮唑)MTT粉末、Triton X-100、牛血清白蛋白和多聚甲醛購自加拿大Sigma-Aldrich公司。此外，活/死細(xì)胞活力測定 試劑盒(CBA415)， Hoechst 33342nucleus Dye 由Sigma-Aldrich(加拿大)提供。此外，抗ki67抗體(ab15580)和Alexa Fluor 546 山羊抗兔IgG (H+L)分別購自Abcam和Invitrogen(加拿大)。

細(xì)胞培養(yǎng)。MDA-MB-231細(xì)胞在T-75瓶中加入10%胎牛血清和1% 100 Uml-1青霉素/鏈霉素的 DMEM中培養(yǎng)。細(xì)胞在5% CO2和37℃條件下孵育，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 80%的合流度時，用 DPBS沖洗細(xì)胞兩次，然后用胰蛋白酶/EDTA (0.25%-1X)懸浮。

生物打印。為了制備生物墨水，根據(jù)歐陽等人38提供的方案，首先用去離子水制備0.5% NaCl溶液。然后加入明膠和褐藻酸鈉鹽粉，劇烈攪拌 1 h。將配制好的溶液在70℃(30 min, 3次)加熱滅菌， 4℃保存后使用。在生物打印之前，使用混合注射器將 MDA-MB-231懸浮液與制備好的明膠/海藻酸鹽溶 液輕輕均勻混合，制成最終濃度為4% (w/v) 明膠，4% (w/v)海藻酸鹽和2-2.5×1 06 MDA-MB-231 細(xì)胞 mL-1的生物墨水。

使用CELLINK INCREDIBLE+ 擠壓生物打印機(jī)進(jìn)行生物打印。將制備好的生物墨水用針擠壓制成三 維細(xì)胞-水凝膠層狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。具體來說，本實(shí)驗(yàn)使用的打印噴嘴為標(biāo)準(zhǔn)錐形噴嘴 (22G)，針的移動速 度調(diào)節(jié)為5mm-1。印刷是在室溫下施加適當(dāng)?shù)膲毫ν瓿傻�。采�?nbsp;Solidwork軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計，在sli3r軟件中切割成10層，尺寸為10 × 10 × 3mm3 ，采用直線填充模式。在打印過程中，我們努力  將壓力保持在最低水平，以使對細(xì)胞活力的損害最小。隨后，將攜帶細(xì)胞的構(gòu)建體浸泡在 3% （w/v） 無菌氯化鈣溶液中（20分鐘），使海藻酸鈉與鈣離子交聯(lián)21。然后，PBS洗滌三次后，每個結(jié)構(gòu)在含有 10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)于12孔板中，在5% CO2和37℃下孵育一段預(yù)定時 間。每隔一天更換一次培養(yǎng)基。

MTT試驗(yàn)。采用MTT法檢測三維網(wǎng)絡(luò)內(nèi)細(xì)胞增殖。預(yù)定孵育天數(shù)后，去除含有 3D結(jié)構(gòu)的12孔板中每孔中的培養(yǎng)基，在每孔中加入900µL新鮮培養(yǎng)基和100µL MTT溶液（0.5 mgmL – 1 in PBS ），在37℃CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h�？刂平M是一個沒有任何細(xì)胞的3D結(jié)構(gòu)。然后，抽吸培養(yǎng)基后，在每孔中加入 1mlDMSO，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中溶解形成的甲醛晶體30min。最后，利用Absorbance Microplate Reader 在540 nm處記錄溶解后的甲醛晶體的強(qiáng)度。

活死檢測。根據(jù)制造商的說明，使用活/死染色活力試劑盒在特定時間點(diǎn)對生物 3D打印的細(xì)胞負(fù)載構(gòu)建體進(jìn)行染色，以確定細(xì)胞活力。簡單地說，每個構(gòu)建體在 PBS中洗滌三次。然后，將1µM Calcein-  AM和2µM碘化丙啶加入染色細(xì)胞，并在黑暗中孵育。使用激光掃描共聚焦顯微鏡 (蔡司LSM 700)對三維 結(jié)構(gòu)內(nèi)的活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行多點(diǎn)成像。然后使用 ImageJ軟件對圖像進(jìn)行分析。細(xì)胞活力通過將綠色 （活）細(xì)胞的數(shù)量除以每張圖像中的細(xì)胞總數(shù)來計算。

細(xì)胞增殖。Ki-67細(xì)胞增殖試驗(yàn)是一種評價體外細(xì)胞增殖的定量技術(shù)。使用這種方法，Ki-67蛋白被用 作細(xì)胞增殖的標(biāo)記物，因?yàn)樗�在活躍的細(xì)胞周期(G1, S, G2和M)表達(dá)，而不是在固定期(G0)表達(dá)。為了完成這篇文章，首先，在預(yù)定的時間步長將每個孔的培養(yǎng)基完全去除，并用PBS洗滌每個支架兩次。然后，將支架在4%多聚甲醛的PBS中室溫孵育1小時，使細(xì)胞固定。固定結(jié)構(gòu)在含有0.1-0.25%Triton X-100的PBS中滲透15分鐘，用PBS洗滌2次。之后，用3% BSA/0.1% Triton X-100在PBS中阻斷 細(xì)胞1小時，然后在PBS/1% BSA中加入濃度為5µgmL-1的Anti-Ki67抗體，在4℃孵育過夜。然后，在加 入山羊抗兔IgG (H+L)二抗之前，用PBS/1% BSA清洗3次，5分鐘，孵育2小時。然后，在加入Hoechst  33,342(孵育1小時)之前，用PBS/BSA重新清洗2次，5分鐘。最后，使用激光掃描共聚焦顯微鏡對細(xì)胞 進(jìn)行成像。

計算方法
細(xì)胞自動機(jī)模型描述。該模型將時間模擬為離散的、均勻的時間步長;每個時間步長為1 h，每次模 擬11天。該模型模擬了采用生物3D打印方法制備的多孔細(xì)胞負(fù)載支架的子域，該子域由190 × 190×30晶格點(diǎn)的方形晶格組成，對稱地由4個寬度為50 × 50 ×30晶格點(diǎn)的孔隙組成。水凝膠內(nèi)的每個 晶格點(diǎn)可以被細(xì)胞占用或保持空缺，而孔隙中的網(wǎng)格點(diǎn)應(yīng)該保持未被占用，因?yàn)橄鄳?yīng)的體外實(shí)驗(yàn)中的 細(xì)胞不會移動到孔隙中(Supplementary Material，圖S2)。通過在水凝膠晶格上的隨機(jī)位置放置指定 初始數(shù)量的細(xì)胞來實(shí)例化模擬。在每個時間步，細(xì)胞的行為都遵循一組描述細(xì)胞過程的隨機(jī)規(guī)則，如 增殖、運(yùn)動和死亡。生物打印中每個時間步內(nèi)的主要算法和進(jìn)程安排如圖9所示。計算框架建立在先  前的理論細(xì)胞群工作之上40,41。使用概述、設(shè)計概念和細(xì)節(jié)(ODD)協(xié)議制定的詳細(xì)模型描述，在補(bǔ)充材 料(補(bǔ)充材料，硅片研究)中提供。

細(xì)胞增殖過程。這個過程是模擬每個細(xì)胞單獨(dú)考慮細(xì)胞之間的變化。單個細(xì)胞的特征是一個特定的， 隨機(jī)的倍增時間，這歸因于每個細(xì)胞完成一個細(xì)胞周期分裂所需的時間。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，每個細(xì)胞的倍增時間從正態(tài)分布中選取，其值為µ=96 h，標(biāo)準(zhǔn)差為 σ=6 h。模擬的細(xì)胞增殖周期過程包括增殖期和非增殖期(G0)之間的過渡。分裂后，親本細(xì)胞保持在當(dāng)前位置，子細(xì)胞可以放置在親本細(xì)胞 附近的一個未占用的晶格點(diǎn)上。如果每個相鄰的位點(diǎn)都已被占用，親本細(xì)胞進(jìn)入g0期，即靜止或靜止 期，此時細(xì)胞變得不活躍42 。一階、二階和三階摩爾鄰域用于放置子細(xì)胞。支架具有指定的最大承載  能力C來容納細(xì)胞，當(dāng)達(dá)到該容量的細(xì)胞總數(shù)時，增殖以指定的概率(P0)終止。承載能力取決于體外  系統(tǒng)的空間和營養(yǎng)限制。C和P0的值根據(jù)體外觀察進(jìn)行校準(zhǔn)。由于支架內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣分布不均，一些細(xì)胞在達(dá)到支架承載能力后仍能增殖，而另一些細(xì)胞則進(jìn)入G0期。這意味著細(xì)胞可以在有足夠的 營養(yǎng)和自由鄰近晶格點(diǎn)的地方繼續(xù)增殖。表S1包含了所有芯片參數(shù)的值。

運(yùn)動的過程。在運(yùn)動過程中，細(xì)胞每移動一個特定的時間，稱為 mc，但由于所有細(xì)胞的運(yùn)動可能不同 步，因此引入一個隨機(jī)數(shù)添加到mc中。mc參數(shù)的值也使用體外數(shù)據(jù)校準(zhǔn)。在這個過程中，單個細(xì)胞可 以以隨機(jī)概率的隨機(jī)方式移動，或者以偏倚概率的偏倚隨機(jī)方式移動，如果在它們的鄰居中有一個自由的晶格點(diǎn)，它們就會改變它們的位置34。細(xì)胞可以以相同的概率向鄰近的六個方向 (右、左、上、下、前、后)中的一個方向移動，這被稱為隨機(jī)運(yùn)動，或者以加權(quán)概率的偏隨機(jī)方式移動，其中細(xì)胞被  其他細(xì)胞和附近的毛孔吸引，這是由體外實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)觀察所激發(fā)的。在偏隨機(jī)運(yùn)動中，我們計算每個 方向(direction-p)的運(yùn)動概率，這取決于一個細(xì)胞在其吸引范圍內(nèi)該方向的鄰近細(xì)胞的數(shù)量，定義  為(Lc)。此外，每個方向的概率可以根據(jù)個體與特定吸引力范圍內(nèi)的孔隙之間的歐幾里得距離 (Lp)而 增加。在隨機(jī)移動情況下，Pup = Pdown = Pleft = right = Pforward = Pbackward = 1/6 ，其中6  為方向數(shù)，Pup、Pdown、Pleft – right 、Pforward、Pbackward分別為細(xì)胞向上、向下、向左、向右 移動的概率。在隨機(jī)偏置情況下，Pup = P1, Pdown = P2, right = P3, Pleft = P4, Pforward =P5, Pbackward = P6 ，其中  6 i=1Pi =1。概率Pi是通過掃描和求和相鄰的細(xì)胞和孔晶格點(diǎn)來計算 的。在補(bǔ)充材料中描述了更多細(xì)節(jié)。最后，每個單元格以更大的趨勢向計算出更高概率的方向移動。

圖9 。體外和硅生物打印的主要步驟。

死亡。在模擬中，我們假設(shè)3D生物打印支架的多孔結(jié)構(gòu)允許所有細(xì)胞獲得營養(yǎng)和氧氣，從而防止由于 缺乏這些重要材料而導(dǎo)致的死亡。然而，如果細(xì)胞在固定相中停留的時間超過特定時間(定義為Cd，在一定范圍內(nèi)校準(zhǔn)，概率為Pd)，細(xì)胞就會失去活力。表S1包含了所有芯片參數(shù)的值。

統(tǒng)計分析。使用Image J軟件對圖像進(jìn)行分析。圖表和報告數(shù)據(jù)中的所有誤差條均表示至少三次重復(fù)的±SD (n≥3)。結(jié)果以mean±SD格式報道。共聚焦顯微鏡圖像的統(tǒng)計數(shù)據(jù)是通過平均每個結(jié)構(gòu)至少 五個不同點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量獲得的。