使用Ghost cytometry進(jìn)行高通量細(xì)胞表型的池式CRISPR篩選的過程介紹

CRISPR基因編輯池式篩選是一種使用CRISPR基因編輯技術(shù)進(jìn)行高通量基因篩選的方法。該方法靈活且高效，能夠在單次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對成千上萬的基因進(jìn)行編輯，為研究者在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域提供了強(qiáng)大的工具。

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是細(xì)菌或古菌的一種免疫機(jī)制，能夠幫助它們抵抗病毒等外源遺傳物質(zhì)的入侵。在2012年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了其在基因編輯上的潛力，他們利用CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白（Cas）能夠被引導(dǎo)至任何DNA序列并精確剪切，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的定向編輯。

池式篩選，即在一個(gè)大的“池子”里，每個(gè)細(xì)胞攜帶一個(gè)不同的基因編輯工具-指導(dǎo)RNA（gRNA）。這種編輯工具可以引導(dǎo)Cas蛋白至特定的基因進(jìn)行編輯。在CRISPR池式篩選中，研究者可以使用含有數(shù)以千計(jì)不同gRNA的質(zhì)粒庫對大量細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使每個(gè)細(xì)胞內(nèi)接收到一個(gè)隨機(jī)的gRNA。

傳統(tǒng)的基因篩選方法通常會(huì)對單個(gè)基因或一小組基因進(jìn)行逐個(gè)測試，這種做法比較耗時(shí)且效率較低。某些篩選方法，例如通過微生物菌落挑選或表達(dá)差異分析等，雖然可以同時(shí)處理多個(gè)樣品，但是每個(gè)基因通常都需要單獨(dú)處理和分析。
 

而“池式篩選”方法則是一種高通量篩選技術(shù)。在一個(gè)“池子”中，每個(gè)細(xì)胞被賦予一個(gè)特定的基因編輯工具，比如CRISPR的gRNA，就形成了一個(gè)大規(guī)模基因編輯池。然后，通過對整個(gè)細(xì)胞池進(jìn)行外部壓力處理，可以一次性篩選出許多對生存或生長有影響的基因。這樣就可以在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中對全基因組進(jìn)行篩選，大大提高了篩選效率。

文章的介紹部分詳述了基于CRISPR的池式篩選方法的幾個(gè)優(yōu)勢，包括提高通量，降低成本，減少了不同篩選中出現(xiàn)的批次效應(yīng)。在池式的表型篩選中，細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)分子被標(biāo)記為熒光染料、報(bào)告基因或熒光免疫抗體。因?yàn)樾枰�量化明確定義的特征，所以基于熒光的標(biāo)記由于其對目標(biāo)分子的高特異性和高靈敏度具有明顯的優(yōu)勢。例如，在熒光激活細(xì)胞分類（FACS）中，從時(shí)間信號中測量的代表性值，如總熒光，或從光學(xué)顯微圖像中評估的更詳細(xì)的特性，如分子定位和形態(tài)參數(shù)。

然而，當(dāng)適用的生物標(biāo)志物或染色方法不可用，能否在用識別特征的圖像分析評估細(xì)胞表型變得具有挑戰(zhàn)性。為了解決這個(gè)挑戰(zhàn)，基于機(jī)器學(xué)習(xí)的無標(biāo)記高內(nèi)容細(xì)胞表型分析成為一個(gè)有希望的替代方案。

在這項(xiàng)研究中，作者展示了一種用于大規(guī)模池化CRISPR篩選的多功能方法，包括熒光和無標(biāo)記高內(nèi)容細(xì)胞表型，利用基于熒光和無標(biāo)簽Ghost Cytometry（GC）技術(shù)的細(xì)胞分類器。

首先，細(xì)胞表達(dá)Cas9蛋白被用池化CRISPR逆轉(zhuǎn)錄病毒庫轉(zhuǎn)導(dǎo)以實(shí)現(xiàn)功能喪失基因集，并選出穩(wěn)定病毒整合。隨后，經(jīng)化合物或試劑處理的池化敲除細(xì)胞庫顯示出多種表型。如有必要，可以進(jìn)行額外的試驗(yàn)，例如免疫染色。在GC-based的細(xì)胞分選中，預(yù)訓(xùn)練的機(jī)器學(xué)習(xí)模型可以選擇性地豐富顯示目標(biāo)高內(nèi)容表型的細(xì)胞。最后，可以將篩選的細(xì)胞進(jìn)行各種生物學(xué)試驗(yàn)，包括基因分析如基因組測序，蛋白質(zhì)試驗(yàn)以及基于細(xì)胞的功能性分析。在標(biāo)準(zhǔn)CRISPR擾動(dòng)篩選中，從篩選細(xì)胞中提取基因組DNA，并由PCR擴(kuò)增sgRNA區(qū)域，然后利用商業(yè)上可得的下一代測序平臺閱讀，以確定導(dǎo)致目標(biāo)表型的基因。當(dāng)篩選活細(xì)胞時(shí)，單細(xì)胞RNA測序的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和基于細(xì)胞的功能試驗(yàn)是廣泛適用的。

所以，整體來看，這種方法結(jié)合了CRISPR基因編輯技術(shù)，無標(biāo)簽高內(nèi)容篩選和機(jī)器學(xué)習(xí)，進(jìn)一步提高了我們對基因功能和表型的理解，以及我們在生物醫(yī)學(xué)研究中的篩選能力。