naica®數(shù)字PCR系統(tǒng)在霍亂弧菌活菌絕對定量檢測的應用

導讀

毒性霍亂弧菌血清群O1和O139是導致全球霍亂流行的病原體�；魜y弧菌可在水中存活，并通過糞-口途徑傳播。提升快速準確監(jiān)測環(huán)境水體中霍亂弧菌的能力是預防和控制霍亂傳播的重要戰(zhàn)略。傳統(tǒng)的平板計數(shù)法被廣泛用于霍亂弧菌的檢測，是檢測的“金標準”，但需要較長的時間和精力。因此，快速準確新檢測方法的開發(fā)是必要的。

文獻解讀：

福建省疾病預防控制中心于Frontiers in Microbiology（影響因子IF：5.2）發(fā)表了名為《Absolute quantification of viable Vibrio cholerae in seawater samples using multiplex droplet digital PCR combined with propidium monoazide》的研究論文，開發(fā)了一種新的檢測方法，將三重數(shù)字PCR（dPCR）與單氮化丙啶（PMA）處理相結合，定量檢測活霍亂弧菌O1/O139和霍亂腸毒素（ctxA）。在模擬海水樣品中評價了PMA-dPCR檢測活菌源DNA的特異性和敏感性。

應用亮點

▶ 與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法相比，數(shù)字PCR技術更省時省力、靈敏度和特異性高、抗干擾能力強。

▶ 使用PMA結合qPCR計數(shù)VBNC狀態(tài)下的霍亂弧菌O1，在同時檢測或區(qū)分活霍亂弧菌O1和O139以及了解ctxA基因的攜帶狀態(tài)方面仍存在局限性，與之相比，使用PMA結合dPCR技術的靈敏度和特異性都更好。

 文章相關結果：

dPCR檢測中，rfb O1、rfb O139和ctxA的最佳引物濃度分別為1μM，而三種探針的濃度分別為0.25、0.25和0.4μM。最佳退火溫度為58°C，以獲得最準確的結果。從PMA處理中區(qū)分活死細菌的最佳策略是在20 μM濃度下孵育15min，然后暴露于650w鹵素燈20 min。

圖例說明：不同PMA濃度處理后的死菌(A) /活菌(B) 及不同光照時間后死菌的(C) qPCR結果。ΔCt=對照組PMA-Ct值-處理實驗組的Ct值。NT：未經(jīng)PMA處理的對照組

在純培養(yǎng)溶液中，霍亂弧菌O1、O139和ctxA的檢測限（LODs）分別為127.91 CFU/mL、120.23 CFU/mL和1.5拷貝/反應，而海水樣品中三個靶標的LODs分別為150.66 CFU/mL、147.57 CFU/mL和2拷貝/反應。

圖例說明：不同PMA濃度處理后的死菌(A) /活菌(B) 及不同光照時間后死菌的(C) qPCR結果。ΔCt=對照組PMA-Ct值-處理實驗組的Ct值。NT：未經(jīng)PMA處理的對照組

在純培養(yǎng)溶液中，霍亂弧菌O1、O139和ctxA的檢測限（LODs）分別為127.91 CFU/mL、120.23 CFU/mL和1.5拷貝/反應，而海水樣品中三個靶標的LODs分別為150.66 CFU/mL、147.57 CFU/mL和2拷貝/反應。

圖例說明：使用三重dPCR同時檢測霍亂弧菌的兩個或三個靶點

圖例說明：采用平板計數(shù)、qPCR、PMA-qPCR和PMA-triplex dPCR定量不同比例活菌下的霍亂弧菌O1和O139

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