線粒體移植技術(shù)綜述及其在體外、體內(nèi)和臨床的應(yīng)用前景

提到線粒體，你能聯(lián)想到哪些相關(guān)詞匯？氧化磷酸化？三磷酸腺苷 (ATP)？不會吧，不會吧，還有人對線粒體的認識只停留在供能階段？！ 目前，越來越多的研究已表明，細胞外的線粒體可被細胞內(nèi)吞，進入到細胞內(nèi)，然后以完整的形態(tài)發(fā)揮作用。嘿嘿，如果你知之甚少，那來看看小 M 給你介紹下 “線粒體移植”吧~

圖 1. 線粒體移植技術(shù)^[1]。
線粒體移植 (MT, Mitochondrial transplantation) 是指將分離獲得的線粒體注射到組織器官的受損部位，或者注射到血液循環(huán)系統(tǒng)，從而發(fā)揮療效的技術(shù)。在細胞水平上，則是指將分離獲得的線粒體轉(zhuǎn)移至靶細胞，來研究線粒體移植效果的技術(shù)。

 

Tips：為什么要進行線粒體移植？

1) 外源線粒體進入到生理環(huán)境中的細胞后，將提高細胞能量供應(yīng)、促進細胞存活；但線粒體進入到缺氧和酸性的腫瘤組織后，將大量產(chǎn)生氧自由基、誘發(fā)細胞死亡。線粒體這種環(huán)境響應(yīng)性的藥理特性，可應(yīng)用于清除腫瘤細胞、恢復(fù)受損組織的功能。

2) 1982 年，Clark 和 Shay 研發(fā)出了第一種將異種來源的線粒體移植到另一個細胞中的方法。2007 年，從大鼠細胞中分離出的線粒體被成功整合到受損的人類間充質(zhì)干細胞 (Mesenchymal stromal cells, MSCs) 中，改善了代謝功能。此后，大量研究表明，線粒體可以整合到細胞中發(fā)揮作用。

3) 近年來，該技術(shù)在體外、體內(nèi)和各種臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，具有防止細胞死亡、減少炎癥、恢復(fù)細胞代謝和適當?shù)难趸�平衡等益處�?/span>

 

小小能量站:

血管里布滿了內(nèi)皮細胞，它們對血管的形成和血液的流動至關(guān)重要。為了治療缺血性疾病，將內(nèi)皮細胞移植到血管阻塞部位附近，以促進血管的形成并恢復(fù)血液流向組織。

然而，這種療法的一個相當大的局限性是內(nèi)皮細胞 (Endothelial cells, ECs) 必須與未分化的干細胞 (間充質(zhì)基質(zhì)細胞, Mesenchymal stromal cell, MSCs) 共同移植 (間充質(zhì)基質(zhì)細胞支持組織修復(fù)和再生)。

目前為止，基質(zhì)細胞促進內(nèi)皮細胞移植的機制尚不清楚。
近期，Nature 報道了一種創(chuàng)新的移植策略來幫助修復(fù)缺血組織。Lin 和他的同事發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞將線粒體轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞，這些線粒體在轉(zhuǎn)移后被降解，促使內(nèi)皮細胞產(chǎn)生自己的新線粒體。
該研究表明，人工將線粒體移植到內(nèi)皮細胞中以模擬這種自然轉(zhuǎn)移，可以通過移植的內(nèi)皮細胞刺激血管的形成 (圖 1)。

圖 1. 線粒體細胞器的轉(zhuǎn)移促進了血管的形成^[2]。 

為了在因血液供應(yīng)不足 (缺血) 而受損的組織中生長新的血管，可以將排列在血管壁上的內(nèi)皮細胞移植到受損的組織中。然而，這些細胞只有在與稱為間充質(zhì)基質(zhì)細胞的干細胞共移植時才能成功形成新血管，這是該療法的一個相當大的并發(fā)癥。(a) Lin 等人 發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞通過被稱為納米管的細胞突起將一些線粒體轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞。轉(zhuǎn)移的線粒體被 PINK1 和 Parkin 蛋白迅速標記為降解，這刺激了新線粒體的產(chǎn)生 (生物發(fā)生)，增強了內(nèi)皮細胞的功能。(b) 為了模擬自然的線粒體轉(zhuǎn)移，作者將從基質(zhì)細胞中分離的線粒體人工移植到內(nèi)皮細胞中，發(fā)現(xiàn)這些線粒體促進的內(nèi)皮細胞移植物是可行的，并且在不需要基質(zhì)細胞的情況下刺激血管的形成。
▐  新機制：MSCs 通過線粒體轉(zhuǎn)移促進 EC 的植入
首先，Lin 等人在存在或不存在支持基質(zhì)細胞 (MSCs) 的情況下將人內(nèi)皮細胞 (ECs) 移植到小鼠皮膚下。并證實，只有共移植的移植物才有形成功能性血管的內(nèi)皮細胞 (圖 2)。在過去的十年中，基質(zhì)細胞已被證明可以自然地將線粒體轉(zhuǎn)移到其他類型的細胞，線粒體轉(zhuǎn)移已被證明可以促進因缺血而受損的組織的再生。

圖 2. 基質(zhì)細胞對人 ECs 的移植至關(guān)重要^[3]。

在免疫缺陷裸鼠皮下植入含有或不含 MSCs 的人內(nèi)皮細胞移植物。7 天的人ECFCs (Endothelial colony-forming cells, 內(nèi)皮集落形成細胞), HUVECs (Human umbilical vein endothelial cells, 人臍靜脈內(nèi)皮細胞)和 wat-ECs (White-adipose-tissue-derived ECs,白色脂肪組織來源的內(nèi)皮細胞)的H&E 染色，突出灌注血管 (黃色箭頭)。

為了研究基質(zhì)細胞 (MSCs) 的線粒體轉(zhuǎn)移是否可以介導(dǎo)移植過程中內(nèi)皮細胞 (ECs)的存活。作者用一種名為 DsRed 的熒光蛋白標記了基質(zhì)細胞中的線粒體。

觀察到 DsRed 標記的線粒體位于長長的突起物 (稱為納米管, Tunnelling nanotubes,TNTs) 中，這些突起物從基質(zhì)細胞延伸出來并與內(nèi)皮細胞直接接觸。24 h 后，可以在新血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細胞內(nèi)看到 DsRed 標記的線粒體 (圖 3)。

圖 3. MSCs 通過線粒體轉(zhuǎn)移促進 EC 的植入^[3]。

 (a) 注射 ECs 和 mitoRed-MSCs 的小鼠示意圖，下圖為帶有 DsRed⁺ 的 TNTs。(b) 免疫熒光技術(shù)鑒定帶有 DsRed⁺ 線粒體的 ECs (mitoRed-ECs)。

 

然而，線粒體的轉(zhuǎn)移出人意料地短暫：它在聯(lián)合移植后立即開始，并在血管穩(wěn)定后停止。此外，選擇性阻斷納米管的形成會破壞線粒體的轉(zhuǎn)移并損害血管形成。這些發(fā)現(xiàn)表明，線粒體通過納米管（TNTs）的瞬時轉(zhuǎn)移是 MSCs 支持 ECs 移植物活力的方式。

▐  外源線粒體人工移植到 ECs 中是否可以增強其植入？

由于當前治療缺血的方法的局限性，作者想知道用線粒體人工啟動內(nèi)皮細胞是否可以模擬聯(lián)合移植的效果。為此，作者將從基質(zhì)細胞中分離出來的線粒體與 ECs 一起孵育，這樣線粒體就可以通過一種稱為內(nèi)吞作用的過程被吸收，實現(xiàn)線粒體的人工移植 (稱為 mitoAT-EC) (圖 4a)。

圖 4. 外源線粒體移植促進 ECs 植入^[3]。 

 (a) 線粒體分離和移植過程示意圖。(b) Seahorse 分析顯示移植后 24 h mitoAT-ECs的呼吸增強(n=6)。OCR: Oxygen consumption rate,耗氧率; OM, Oligomycin，寡霉素; FCCP，Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl hydrazone，羰基氰化物-對三氟甲氧基苯腙; R&A，rotenone andantimycin A，魚藤酮和抗霉素。(c) Seahorse 分析產(chǎn)生 ATP。(d) ECs 與 mitoAT-ECs 的功能比較: H₂O₂ 暴露后 ATP 生成。(e) 小鼠移植 ECs 或 mitoAT-ECs 結(jié)果圖示。
這種人工線粒體移植復(fù)制了自然轉(zhuǎn)移過程，受體內(nèi)皮細胞的代謝活性增強 (圖 4b-d)。在糖尿病裸鼠的缺血后肢模型中，mitoAT-EC 的植入水平顯著提高，可有效改善血流并防止組織壞死 (圖2i-p)。線粒體移植對 ECs 的增強功能可能并不直接依賴于線粒體的功能性。
▐  外源線粒體移植誘導(dǎo) mitoAT-EC 細胞自噬

從基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)移過來的線粒體不需要有增強內(nèi)皮細胞移植物的功能，因為轉(zhuǎn)移過來的線粒體在一個叫做線粒體自噬的過程中迅速降解，而不是與現(xiàn)有的線粒體池融合。

作者在內(nèi)皮細胞的自噬體中觀察到人工移植的線粒體，但是當他們通過沉默編碼 PINK1 或 Parkin 的基因表達來破壞線粒體自噬時，這阻止了線粒體被這些囊泡吞沒，即在受體內(nèi)皮細胞中沉默 Parkin (由 PRKN 編碼) 可以消除 mitoAT-EC 中LC3B+ 自噬體的形成 (圖 5a-b)。

 

 

圖 5. 外源線粒體移植誘導(dǎo) mitoAT-EC 細胞自噬^[3]。  

(a) 免疫熒光顯示移植 24 h 后 mitoAT-EC 中外源性 DsRed⁺ 線粒體 (紅色 )與內(nèi)源性 Parkin (Alexa 647) 共定位 (白色箭頭)。(b) mitoAT-EC 中 LC3B+ 自噬體的免疫熒光檢測。Parkin 和 PINK1 沉默 (shRNA) 對供體 MSC 線粒體 (mito) 或受體 EC 的影響，DAPI 為細胞核。(c) 沉默 PINK1 和 PRKN 對間充質(zhì)干細胞共植內(nèi)皮細胞植入能力的影響: 第7天血管灌注移植物 (箭頭) 的觀察和 H&E 染色。(d) 圖中顯示 Parkin (受體 ECs) 和 PINK1(供體線粒體)在 mitoAT-ECs 中自噬激活中的作用。

同時，當使用 shPRKN-ECs 或 shPINK1-MSCs 時，含有 ECs 和 MSCs 的移植物在第 7 天的血管形成明顯減少 (圖 5c)。值得注意的是，線粒體自噬誘導(dǎo)受體內(nèi)皮細胞產(chǎn)生新的線粒體 (線粒體生物發(fā)生)，從而增強細胞功能并刺激血管形成。在機制上，這些結(jié)果證實了 PINK1-Parkin 途徑介導(dǎo)線粒體自噬，而線粒體自噬反過來調(diào)節(jié)線粒體移植后 mitoAT-EC 所表現(xiàn)出的增強的植入能力 (圖 5d)。

這項研究揭示了細胞應(yīng)激條件下的線粒體轉(zhuǎn)移機制，體外人工線粒體移植可以有效提高 ECs 在缺血組織中的移植能力，從而形成新的血管，并且線粒體移植不依賴于其他細胞類型，大大降低了臨床轉(zhuǎn)化的難度，具有重要的研究意義。

 

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Mdivi-1 Mdivi-1 是一種有效的線粒體分裂/線粒體自噬 (mitophagy) 抑制劑。

AICAR 阿卡地新  AICAR (Acadesine) 是一種腺苷類似物，也是一種 AMPK 激活劑。AICAR 調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)的代謝，并抑制促炎細胞因子和 iNOS 的產(chǎn)生。AICAR 也是一種自噬 (autophagy)，YAP 和 mitophagy 抑制劑。

Adezmapimod Adezmapimod 不抑制 JNK 活性，是一種自噬 (autophagy) 和線粒體自噬 (mitophagy) 激活劑。

Olaparib Olaparib 是一種自噬 (autophagy) 和線粒體自噬 (mitophagy) 激活劑。

CCCP CCCP 是氧化磷酸化 (OXPHOS) 解偶聯(lián)劑。CCCP 誘導(dǎo) PINK1 激活，促進 Parkin 在 Ser65 位點磷酸化。

Salinomycin  Salinomycin 是 Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)的有效抑制劑，阻斷 Wnt 誘導(dǎo)的 LRP6 磷酸化。 FCCP FCCP 是線粒體中氧化磷酸化 (OXPHOS) 解偶聯(lián)劑。FCCP 誘導(dǎo) PINK1 激活，促進 Parkin 在 Ser65 位點磷酸化。

[1] Main EN, et al. Mitochondria as a therapeutic: a potential new frontier in driving the shift from tissue repair to regeneration. Regen Biomater. 2023 Aug 12;10:rbad070.

[2] Evans CS. Cells destroy donated mitochondria to build blood vessels. Nature. 2024 May;629(8012):539-541. 
[3] Lin RZ, et al. Mitochondrial transfer mediates endothelial cell engraftment through mitophagy. Nature. 2024 May;629(8012):660-668.