快速色譜法在簡單碳水化合物純化中的應(yīng)用

01 摘要

碳水化合物化合物可利用 RediSep Gold Amine 色譜柱結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測（ELSD）進(jìn)行簡便的純化。該色譜柱采用親水相互作用液相色譜（HILIC）梯度洗脫法，以乙腈或丙酮與水的梯度進(jìn)行操作。將待純化的樣品溶解于 DMSO 中，不僅允許大量樣品加載，同時還能保持良好的分辨率。

02 背景

碳水化合物通常采用氨基柱進(jìn)行分析，該方法具有良好的分辨率。這種分析方法一般使用乙腈和水作為流動相，樣品通常溶解在水中。由于樣品注射量較小，樣品有機會吸附在固定相上。在制備色譜中，相對于色譜柱尺寸而言，樣品負(fù)載和注射體積要大得多，因此將樣品溶于水中注射可以防止碳水化合物吸附在柱子上，導(dǎo)致它們在空隙處洗脫。干法加載樣品到固體裝載小柱上通常用于快速色譜，但用戶需要自己用氨基介質(zhì)填充他們的小柱。樣品仍然溶解在水中進(jìn)行加載，這需要很長時間才能在運行樣品前蒸發(fā)。

二甲基亞砜（DMSO）常用于反相色譜的樣品溶解，因為它能溶解大多數(shù)化合物。DMSO 能夠溶解碳水化合物，但在 HILIC 中是一種弱溶劑，因此它允許樣品吸附在柱子上。在使用氨基柱時，DMSO 在洗脫早期被洗脫；然而，在采用非氨基介質(zhì)的其他 HILIC 運行中，它可能在梯度洗脫的后期才被洗脫。

03 結(jié)果與討論

雖然親水相互作用液相色譜（HILIC）屬于正相色譜，但它使用的溶劑通常適用于反相色譜，因此需要根據(jù)表 1 中的設(shè)置調(diào)整蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）的參數(shù)，以保持基線穩(wěn)定的同時維持靈敏度。

表1. 純化碳水化合物的蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）設(shè)置。

樣品均溶解于 DMSO 中。如有必要，將樣品在熱水浴中加熱以促進(jìn)溶解。使用 PeakTrak Flash Focus 梯度生成器在系統(tǒng)上開發(fā)方法。運行了一個偵查梯度以驗證樣品能夠被洗脫，并證明化合物之間有足夠的分辨率以實現(xiàn)成功的純化。所需化合物的保留用于計算聚焦梯度的溶劑組成。所有運行均使用 RediSep Gold^® 氨基柱。運行完成后，用2-丙醇洗滌并儲存柱子，2-丙醇與有機溶劑混溶，可實現(xiàn)較少極性化合物的快速純化。

第一個實例使用了核糖和葡萄糖。偵查梯度和聚焦梯度都使用乙腈作為弱溶劑。偵查運行只用了少量幾毫克，并且為了提高這個小樣品負(fù)載的靈敏度，ELSD 增益被調(diào)高到 3。第二個洗脫峰用于聚焦梯度；計算梯度后，ELSD 增益被重置為 1 以保持 ELSD 響應(yīng)在量程內(nèi)�？倶悠坟�(fù)載為 100 毫克，使用 50 克 RediSep Gold Amine 柱。

果糖和蔗糖通常一起出現(xiàn)在樣品中。圖 2 展示了從葡萄糖雜質(zhì)中純化果糖的過程。該混合物以與核糖-葡萄糖樣品類似的方式運行，梯度聚焦于葡萄糖。在約 1.8 柱體積（CV）出現(xiàn)的峰是用于溶解樣品的 DMSO。

圖2. 使用 RediSep Gold Amine 柱和乙腈/水梯度從蔗糖中純化不純的果糖。

04 丙酮作為弱溶劑

丙酮也是 HILIC 的弱溶劑，可以替代乙腈使用。盡管醇類可以用于 HILIC，但這些溶劑對于在胺柱上純化碳水化合物來說太強了。使用丙酮純化了一個果糖和葡萄糖的樣品。

該混合物的純化方式與之前的例子相似，除了偵查梯度使用了一根 15.5 克的 RediSep Gold Amine 柱，因為 PeakTrak 允許使用任何尺寸的 Teledyne ISCO 柱進(jìn)行偵查運行。聚焦梯度使用了一根 50 克的 RediSep Gold Amine 柱，但計算出的梯度需要較低的水濃度來純化葡萄糖，這表明對于這些化合物，丙酮是比乙腈更強的溶劑。

圖3. 使用丙酮/水梯度純化的果糖和蔗糖。偵查運行使用了一根 15.5 克的 RediSep Gold 胺柱。

05 結(jié)論

使用 NextGen 300+ 配備蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）和 RediSep Gold 胺柱，通過 HILIC 梯度方法可以高效純化碳水化合物。使用 DMSO 溶解樣品既保證了高樣品負(fù)載量，又保持了良好的分辨率。PeakTrak Flash Focus 梯度生成器使得 Teledyne ISCO 制造的所有色譜柱都能快速開發(fā)和放大方法。