空間轉(zhuǎn)錄組學在揭示獨特和保守的腫瘤核心和邊緣結(jié)構(gòu)中的應用

期刊：Nature Communications
影響因子：16.6
主要技術(shù)： ScRNA-seq、ST

導語

腫瘤微環(huán)境的空間組織對生物學和治療反應有著深遠的影響。對hpv陰性口腔鱗狀細胞癌(OSCC)進行了單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組學分析，以全面表征腫瘤核心(TC)和前沿(LE)轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)中的惡性細胞。發(fā)現(xiàn)TC和LE具有獨特的轉(zhuǎn)錄譜，鄰近的細胞組成和配體-受體相互作用的特征。證明了與LE相關的基因表達譜在不同的癌癥中是保守的，而TC是組織特異性的，突出了腫瘤進展和侵襲的共同機制。此外，發(fā)現(xiàn)LE基因標記與較差的臨床結(jié)果相關，而TC基因標記與多種癌癥類型的預后改善相關。最后，使用計算機建模方法，描述了OSCC中可預測的與藥物反應相關的細胞發(fā)育的空間調(diào)節(jié)模式。作者的工作提供了對TC和LE生物學和交互式空間地圖集的泛癌癥見解(http://www.pboselab.ca/spatial_ OSCC/;http://www.pboselab.ca/dynamo_OSCC/)，這可以為開發(fā)新的靶向治療奠定基礎。

主要技術(shù)
ScRNA-seq、ST

研究結(jié)果
1. OSCC樣本的ST譜分析和細胞反褶積
使用10x Genomics Visium平臺對來自10例獨特患者的12個新鮮冷凍的手術(shù)切除的OSCC樣本進行了ST檢測。從24876個點的轉(zhuǎn)錄組被測序到每個點43648個標準化后的平均reads。對每個腫瘤樣本的蘇木精和伊紅（H&E）染色圖像進行了檢查，并對形態(tài)學區(qū)域進行了注釋。通過對單獨的、公開的HNSCC scRNA-seq數(shù)據(jù)集的ST數(shù)據(jù)進行整合分析，確定了病理注釋的鱗狀細胞癌區(qū)域中存在的惡性腫瘤細胞和其他細胞亞群的組成。為了識別惡性腫瘤斑點，嚴格地描述惡性細胞為反褶積評分>0.99，或CNV概率評分>0.99。CNV分析顯示3號染色體反復缺失，9號染色體出現(xiàn)擴增。經(jīng)過對分類的細胞進行批效應校正和降維后，ST反映了轉(zhuǎn)錄譜的連續(xù)體。空間反褶積分析顯示，幾乎所有樣本中都存在癌細胞、ecm-myCAF、中間成纖維細胞、detox-iCAFs、樹突狀細胞、肥大細胞、巨噬細胞和細胞毒性CD8+ T細胞類型。

Fig 1. OSCC患者樣本的ST分析和細胞反褶積實驗設計概述

2. 無監(jiān)督聚類結(jié)果顯示，TC和LE是腫瘤微環(huán)境的功能異質(zhì)性成分
在識別和注釋了主要由癌細胞組成的惡性腫瘤spot后，進行了無監(jiān)督的louvain聚類，以揭示癌細胞表達譜的空間異質(zhì)性。生成了14個louvain簇，這些簇可被劃分為3個主要cluster。通過差異基因表達分析對主要的聚類進行了表征。將cluster1標注為“腫瘤核心”（TC），將cluster3標注為“前沿”（LE）。cluster2由于其TC和LE DEG程序的組成而被注釋為“短暫性”。

從兩個空間區(qū)域內(nèi)的整個轉(zhuǎn)錄組基因表達譜中生成了一個相關矩陣。在不同患者的TC內(nèi)和LE內(nèi)，通常觀察到高度的相關性。LE點顯示出與細胞周期、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和血管生成相關的基因的高表達。LE中的EMT評分也在很大的范圍內(nèi)表達，與EMT連續(xù)體模型一致。IPA預測了GP6、EIF2和HOTAIR調(diào)控典型信號通路在患者LE中的激活。這些特征可能反映了OSCC LE在控制侵襲性和轉(zhuǎn)移性行為中的作用。這些發(fā)現(xiàn)提示OSCC可能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫反應，并具有促進或抑制腫瘤進展的作用。
 

Fig 2. TC和LE是OSCC微環(huán)境中空間獨特的區(qū)域

3.TC和LE中的不同的癌細胞狀態(tài)
在幾個患者的同一腫瘤微環(huán)境中可能存在多個分子亞型，但亞型組成的模式并不一致�？傮w來說，基礎亞型的TC狀態(tài)最豐富，而非典型亞型的TC狀態(tài)最豐富。典型的OSCC標記物在LE和TC之間的表達沒有顯著差異。此外，在整個UMAP投影中，CSC標記物的表達均勻，表明CSC群體在整個OSCC腫瘤中均可見。TC和LE的獨特生物學譜可以通過獨特的癌細胞狀態(tài)的存在來解釋——保守的基因表達程序從特定的腫瘤微環(huán)境相互作用中動態(tài)表現(xiàn)出來——包括CSC和非干細胞樣惡性細胞。先前探索動態(tài)CSC狀態(tài)的文獻提出，LE中存在間充質(zhì)樣CSCs，TC中存在上皮樣CSCs。當將與這些不同的CSC狀態(tài)相關的基因集評分到ST數(shù)據(jù)集時，結(jié)果證實了LE中間充質(zhì)樣CSC狀態(tài)存在高充質(zhì)樣CSC表達，TC中存在上皮樣CSC狀態(tài)。通過對連續(xù)組織切片的免疫熒光染色，進一步驗證了這些CSC狀態(tài)的定位，發(fā)現(xiàn)CD24標記在TC，CD44標記在LE。這些發(fā)現(xiàn)加強了TC和LE生態(tài)位內(nèi)的可塑性，從而促進轉(zhuǎn)錄獨特的癌細胞狀態(tài)的繁殖。

4. TC和LE結(jié)構(gòu)顯示出不同的配體-受體相互作用
使用CellChat軟件包進行了細胞間的通信分析。ANGPTL、GRN、NECTIN和EPHB信號通路只存在于TC中，CSPG4只存在于LE中。一些ECM重構(gòu)途徑，包括膠原蛋白、肌腱蛋白和層粘連蛋白，在TC和LE中也有表達。相對于TC-TC信號通路，LE-LE信號通路中上調(diào)的輸出信號模式加強了這些通路在促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。

TC-TC癌細胞信號通路可以通過粘附配體-受體對DSC2-DSG1和ANGPTL4- SDC1等方式發(fā)生。LE-LE癌細胞可以通過粘附配體-受體對LAMB3- ITGA6_ITGB4和LAMB3-ITGA6_ITGB1，以及炎癥配體受體對MIF-CD74_CD44發(fā)出信號。MIF-CD74配體-受體對先前已經(jīng)被確定可以啟動致癌信號通路。

相對于TC點，富集細胞毒性CD8（+）T細胞、ecm-myCAF、中間成纖維細胞和巨噬細的鄰近點數(shù)量顯著增加。TC和LE中的惡性細胞參與了不同的細胞-細胞通信模式，進一步塑造了它們獨特的生物學特性。
 

Fig 3. TC和LE癌細胞狀態(tài)具有不同的實體，具有獨特的配體和受體相互作用

5. TC和LE基因特征在癌癥中是保守的，它們對預后的影響是不同的
在TC點、LE點和所有其他剩余的點上訓練了三個基于機器學習（ML）概率的預測模型，以生成一個空間-區(qū)域預測模型。將預測ML模型應用于橫跨17種不同癌癥類型的30個公開可用的ST樣本，以描述每個樣本中的每個點為“TC”、“LE”、“短暫性”或“其他剩余點”。模型10倍交叉驗證顯示，在所有模型中LE區(qū)域的ROC最低，因為其靈敏度相對較低，為0.694。在黑色素瘤（SKCM）、結(jié)直腸腺癌（COAD）、皮膚鱗狀細胞癌（cSCC）和宮頸鱗狀細胞癌（CESC）樣本的空間分離癌細胞狀態(tài)中表現(xiàn)良好。在所有30個樣本中都發(fā)現(xiàn)了高度空間分離的LE點。模型在識別cSCC、黑色素瘤、CESC和COAD組織切片中的TC斑點方面表現(xiàn)特別好，這可能歸因于這些癌癥中存在角化程序。這些開創(chuàng)性的結(jié)果表明，LE相關的表達狀態(tài)在多種癌癥環(huán)境中是保守的，而與TC相關的表達譜更具有組織特異性。

為了檢驗LE和TC的預后意義，納入了來自包含匹配生存數(shù)據(jù)的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集（TCGA）的樣本。共選擇275例hpv陰性OSCC患者進行生存分析，根據(jù)TC和LE中差異表達基因的表達對每個樣本進行富集評分。生成Kaplan-Meier曲線，以可視化總生存（OS）、疾病特異性生存（DSS）和無進展間期（PFI）與TC和LE信號高或低表達之間的差異。

由于LE狀態(tài)似乎適用于不同的癌癥類型，進一步確定了LE特征對預后的影響，并將分析擴展到TCGA中的20種常見實體腫瘤。在多種癌癥中，除了OS和肺鱗狀細胞癌（LUSC）外，高LE評分與較差的OS和DSS始終相關。除了黑色素瘤（SKCM）和LUSC外，LE和PFI之間也存在類似的關聯(lián)模式。較低的TC特征評分與較高的淋巴結(jié)分期、淋巴血管侵犯、較高的腫瘤分級、陽性邊緣和囊外擴散；而較高的LE特征評分與任何臨床特征無關。
 

Fig 4. 機器學習模型識別了多種癌癥類型的保守TC和LE特征

6. 通過分析TC和LE之間的RNA剪接動力學，揭示了分化軌跡
利用scVelo，它通過解釋基因特異性轉(zhuǎn)錄動力學，建立在RNA速度的基礎上，來表征TC和LE中存在的癌細胞的發(fā)育軌跡。在空間去卷積的癌細胞中免疫球蛋白（Ig）基因已在幾種上皮性癌癥中檢測到。雖然確切的機制尚不清楚，但腫瘤來源的Igs與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、免疫逃逸和EMT樣表型的介導有關。這些發(fā)現(xiàn)預測，TC經(jīng)歷了分化增加，保留了上皮樣表型，而LE變得越來越間充質(zhì)。TC和LE中其他差異剪接的驅(qū)動基因包括原癌基因和腫瘤抑制基因。

7. 獲得OSCC的治療靶點
應用了一種計算機微擾方法來識別可能預測OSCC治療成功的RNA速度的保守模式。分析了至少25個HPV陰性HNSCC細胞系中417種藥物的PharmacoDB藥物反應數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)140種藥物-基因相互作用被確定為從DGIdb70上調(diào)或下調(diào)。在高AAC藥物相對于低AAC藥物的凈流出LE轉(zhuǎn)移概率的定量測量顯著增加。在幾種無效藥物(低AAC)中發(fā)現(xiàn)了相反的表型，顯示出與基線狀態(tài)相似的過渡層次。
 

Fig 6. RNA剪接動力學分析揭示了TC和LE的不同發(fā)育軌跡和治療脆弱性

參考文獻：
Arora R, Cao C, Kumar M, Sinha S, Chanda A, McNeil R, Samuel D, Arora RK, Matthews TW, Chandarana S, Hart R, Dort JC, Biernaskie J, Neri P, Hyrcza MD, Bose P. Spatial transcriptomics reveals distinct and conserved tumor core and edge architectures that predict survival and targeted therapy response. Nat Commun. 2023 Aug 18;14(1):5029. doi: 10.1038/s41467-023-40271-4IF: 16.6 Q1 . PMID: 37596273; PMCID: PMC10439131.