免疫細(xì)胞電轉(zhuǎn)案例：電轉(zhuǎn)利器--NEPA21應(yīng)用于細(xì)胞與基因治療

伴隨著免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和病毒學(xué)等學(xué)科的發(fā)展以及細(xì)胞制造和基因工程技術(shù)的進(jìn)步使得免疫細(xì)胞治療各疾病的研究取得了令人振奮的進(jìn)展，該進(jìn)展也使免疫細(xì)胞療法從研究機(jī)構(gòu)小規(guī)模研究的治療方法一躍成為全球企業(yè)開發(fā)的焦點(diǎn)�；�因工程和臨床規(guī)模的基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展以及相關(guān)藥企的投資，使免疫細(xì)胞療法在當(dāng)今以及未來幾十年內(nèi)對(duì)人類健康產(chǎn)生重大的影響。免疫細(xì)胞療法利用患者自身的免疫系統(tǒng)對(duì)抗疾病，而免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)的基因工程改造是免疫細(xì)胞療法的先決條件。例如在CAR-T治療中，患者的T細(xì)胞在體外被進(jìn)行基因改造表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原受體，從而使CAR-T細(xì)胞能夠在患者體內(nèi)靶向殺傷特定的癌細(xì)胞。

免疫細(xì)胞基因編輯技術(shù)的關(guān)鍵步驟是需要將細(xì)胞外源物質(zhì)（DNA\RNA\RNP等）導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)從而實(shí)現(xiàn)相關(guān)的基因編輯，然而目前該技術(shù)的挑戰(zhàn)在于使用傳統(tǒng)的病毒轉(zhuǎn)染方法存在傳統(tǒng)的病毒轉(zhuǎn)染方法存在引起宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致療效降低以及生物安全等問題，而電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)具備無毒性、效率高等特點(diǎn)繞過了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法的潛在缺陷，因此電轉(zhuǎn)染技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。做為在細(xì)胞轉(zhuǎn)染和融合領(lǐng)域擁有超過二十年的研究經(jīng)驗(yàn)的NEPA GENE公司來說，其代表產(chǎn)品NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)自上市以來備受國內(nèi)外眾多用戶的青睞。在免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面，NEPA21均被研究者們用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，積累了豐富的轉(zhuǎn)染條件、產(chǎn)品應(yīng)用等寶貴的經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)。以下列舉的是近年來科研人員使用NEPA21在免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染的部分案例：

案例1 使用NEPA21電轉(zhuǎn)人NK細(xì)胞

參考文獻(xiàn)：Ng Y Y, Du Z, Zhang X, et al. CXCR4 and anti-BCMA CAR co-modified natural killer cells suppress multiple myeloma progression in a xenograft mouse model[J]. Cancer Gene Therapy, 2022.

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：CXCR4 mRNA

電轉(zhuǎn)參數(shù)：穿孔電壓240V,脈沖長度2ms，脈沖次數(shù)1次

多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma, MM）是一種以骨髓漿細(xì)胞克隆擴(kuò)增和免疫球蛋白異常積聚為特征的B細(xì)胞腫瘤，以溶解性骨病為標(biāo)志。近年來，嵌合抗原受體（CAR）細(xì)胞療法已成為一種新的治療MM的方法，而在CAR細(xì)胞治療MM的潛在靶點(diǎn)中，B細(xì)胞成熟抗原（BCMA）是一個(gè)理想的靶點(diǎn)。目前的BCMA特異性CAR細(xì)胞療法使用來自患者的自體T細(xì)胞或NK細(xì)胞，而NK細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到骨髓依賴于CXCR4的表達(dá)，CXCR4是一種趨化因子受體，與骨髓表達(dá)小眾的趨化因子CXCL12/SDF-1α結(jié)合。

基于此，在該研究中為了產(chǎn)生表達(dá)CXCR4的NK細(xì)胞，將0.2ml的擴(kuò)增后的10⁷個(gè)NK細(xì)胞與10μg CXCR4 mRNA混合，使用NEPA21電轉(zhuǎn)儀在2mm電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，下游實(shí)驗(yàn)電轉(zhuǎn)染方法也被用于在NK細(xì)胞上表達(dá)抗BCMA CAR受體。電轉(zhuǎn)染后檢測(cè)檢測(cè)CXCR4分子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：模擬NK細(xì)胞和經(jīng)CXCR4WT RNA電穿孔的NK細(xì)胞在細(xì)胞遷移方面無顯著差異（P=0.159，圖1C）。進(jìn)一步證明，CXCR4R334X mRNA和CXCR4WT mRNA的電穿孔不影響NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解功能，并且兩種類型的CXCR4修飾的NK細(xì)胞能夠像模擬電穿孔的NK細(xì)胞一樣有效地溶解K562細(xì)胞（圖1D）。接下來，作者也測(cè)試了CXCR4r334x修飾的NK細(xì)胞會(huì)更有效地遷移到NSG小鼠的骨髓腔室（圖1E）。結(jié)論是體外擴(kuò)增NK細(xì)胞中CXCR4的過表達(dá)可有效促進(jìn)其向骨髓遷移。

圖1.通過mRNA電穿孔過表達(dá)CXCR4R334X可提高NK細(xì)胞的遷移和歸巢能力（A:在NK細(xì)胞體外擴(kuò)增前后，用CXCR4WT mRNA或CXCR4R334X mRNA電穿孔（電穿孔后8h）后，分析CXCR4在NK細(xì)胞中的表達(dá)D:轉(zhuǎn)染mRNA的NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞株的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，證明電穿孔對(duì)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性沒有影響。

在后續(xù)電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中，作者提到電轉(zhuǎn)后NK細(xì)胞的活力70-80%，其中約90%的NK細(xì)胞被轉(zhuǎn)染以表達(dá)CARs（圖2）。

圖2.電轉(zhuǎn)后，NK細(xì)胞的存活率為70—80%，轉(zhuǎn)染效率為90%

案例2基于CRISPR/cas9的基因編輯法使用NEPA21電轉(zhuǎn)染人的T細(xì)胞

參考文獻(xiàn)：Ito Y, Inoue S, Nakashima T, et al. Epigenetic profiles guide improved CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in human T cells[J]. Nucleic acids research, 2024.

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：RNP復(fù)合物

電轉(zhuǎn)參數(shù)：穿孔脈沖：電壓275V，脈沖時(shí)長1ms，脈沖間隔50ms，脈沖2次，衰減率10%，極性+；轉(zhuǎn)移脈沖：電壓20V，脈沖時(shí)長50ms，脈沖間隔50ms，脈沖5次，衰減率40%，極性+/-。

在免疫細(xì)胞過繼免疫治療中，對(duì)特定基因進(jìn)行基因修飾是增強(qiáng)抗腫瘤免疫細(xì)胞功能的有效手段。目前CRISPR/Cas9技術(shù)的進(jìn)展使得在體外制備輸注的T細(xì)胞產(chǎn)品時(shí)，可通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RNP實(shí)現(xiàn)基因敲除。然而選擇最佳的gRNAs仍是有效基因敲除的主要挑戰(zhàn)。在本實(shí)驗(yàn)中作者利用人類T細(xì)胞中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除的匯總數(shù)據(jù)探索了一種選擇最佳gRNA的方法。作者使用了高通量測(cè)序（ATAC-seq）法從轉(zhuǎn)座酶及染色質(zhì)中獲得的培養(yǎng)T細(xì)胞的表觀遺傳譜數(shù)據(jù)，將表觀遺傳信息與基于序列的預(yù)測(cè)工具相結(jié)合，顯著提高了基因編輯效率（圖1）。并且進(jìn)一步證明，通過在相鄰區(qū)域設(shè)計(jì)兩個(gè)gRNA，可以靶向表觀遺傳封閉區(qū)域。該實(shí)驗(yàn)證明了通過IL-7預(yù)處理可以提高未活化T細(xì)胞的基因編輯效率。這些發(fā)現(xiàn)使得在人類T細(xì)胞中進(jìn)行更有效的基因編輯成為可能。

圖1.基于ATAC-seq與IL-7的預(yù)處理，顯著提高T細(xì)胞的基因編輯效率。

由于病毒轉(zhuǎn)染方法獲得的數(shù)據(jù)已經(jīng)構(gòu)建了許多用于設(shè)計(jì)gRNA的預(yù)測(cè)工具，但尚不確定這些發(fā)現(xiàn)是否適用于電轉(zhuǎn)染RNP的情況。因此在研究CAR-T細(xì)胞的基因工程中，作者利用Cas9-gRNA RNP復(fù)合物的瞬態(tài)電穿孔來增強(qiáng)其功能，在T細(xì)胞激活后5天內(nèi)，使用NEPA 21電穿孔器（NEPA GENE）將核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）進(jìn)行電穿孔到T細(xì)胞中。48-72h后，提取基因組DNA,通過PCR擴(kuò)增含有目標(biāo)位點(diǎn)的基因組區(qū)域，并將擴(kuò)增子進(jìn)行Sanger測(cè)序。使用CRISPR編輯推斷（ICE）分析計(jì)算每個(gè)gRNA的編輯效率。使用Indel百分比來評(píng)估CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯效率（使用TYE 563標(biāo)記的RNA去判斷RNP復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效果）。采用電轉(zhuǎn)染方法，作者積累了205個(gè)gRNA針對(duì)110個(gè)基因的Indel百分比數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)效率在不同的靶位點(diǎn)之間變化很大（圖2A）。

圖2A.CRISPR/ cas9介導(dǎo)的人類T細(xì)胞基因編輯效率的gRNA設(shè)計(jì)算法的驗(yàn)證,分別用Cas9-gRNA復(fù)合物電穿孔T細(xì)胞，分析基因編輯效率（n = 205個(gè)靶標(biāo)）。

采用同樣的電穿孔參數(shù)，將TET2（圖3B）、DOT1L（圖3D）和PRDM1（圖3F）敲除時(shí)可增強(qiáng)T細(xì)胞早期記憶表型的維持，并計(jì)算Indel百分比。

圖3.(A)gRNA設(shè)計(jì)在兩個(gè)近端區(qū)域；兩個(gè)gRNA單獨(dú)或聯(lián)合電穿孔TET2 (B)、DOT1L(D)和PRDM1(F)時(shí)，計(jì)算Indel百分比

為了研究了組成性表達(dá)的Cas9和gRNA是否最終能夠切割染色質(zhì)關(guān)閉狀態(tài)的靶位點(diǎn)，用Cas9和gRNA穩(wěn)定地電轉(zhuǎn)染人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat，這些gRNA靶向9個(gè)基因內(nèi)的表觀遺傳封閉區(qū)和2個(gè)基因內(nèi)的開放區(qū)作為陽性對(duì)照。觀察到Cas9和gRNAs穩(wěn)定表達(dá)的Jurkat細(xì)胞的Indel百分比逐漸增加，到第14天達(dá)到60 - 100%。這些結(jié)果表明，組成型表達(dá)的Cas9和gRNA基因敲除受封閉表觀遺傳狀態(tài)的阻礙較小。

接下來作者檢測(cè)了IL-7預(yù)培養(yǎng)是否會(huì)影響未刺激T細(xì)胞的基因編輯效率（圖4A）。有趣的是，在所有測(cè)試基因中，IL-7處理后，Indel百分比逐漸提高（圖4B）。這些結(jié)果表明，IL-7預(yù)處理可以對(duì)未受刺激的T細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾,聯(lián)合使用IL-7預(yù)處理和雙gRNA靶向進(jìn)一步提高了未活化T細(xì)胞的基因編輯效率（圖4B）。增強(qiáng)基因編輯的機(jī)制之一可能與RNP復(fù)合物有效進(jìn)入T細(xì)胞有關(guān)。事實(shí)上，IL-7預(yù)培養(yǎng)增加了T細(xì)胞對(duì)熒光染料TYE 563標(biāo)記的雙工RNA的攝取，表明轉(zhuǎn)染效率提高。一般來說，體積小的細(xì)胞需要較大的外電場(chǎng)才能實(shí)現(xiàn)滲透。Naïve經(jīng)過IL-7預(yù)培養(yǎng)后，T細(xì)胞的細(xì)胞大小增加，這可能在一定程度上有助于RNP復(fù)合物的高效轉(zhuǎn)染。

圖4.在未激活的T細(xì)胞中，IL-7預(yù)處理可增強(qiáng)基因編輯效率。(A)電穿孔實(shí)驗(yàn)方案示意圖。將未激活的T細(xì)胞在IL-7的存在下培養(yǎng)，指定的時(shí)間段用Cas9/gRNA電穿孔，(B)所示數(shù)據(jù)為每種情況下靶向DPH1、FURIN和SELL的gRNA的估計(jì)指數(shù)百分比。

總之，該研究證明了在選擇最佳的人T細(xì)胞CRISPR/Cas9靶點(diǎn)時(shí)需考慮表觀遺傳譜的重要性，結(jié)合ATAC-seq數(shù)據(jù)和可用的預(yù)測(cè)工具（利用Cas9/gRNA RNP復(fù)合物電穿孔人類T細(xì)胞的數(shù)據(jù)，研究這些工具如何精確地預(yù)測(cè)靶向效率）支持鑒定有效的gRNA靶標(biāo)。這些發(fā)現(xiàn)為人類T細(xì)胞的基因編輯提供了大量有效信息。

案例3使用NEPA21電轉(zhuǎn)染人、小鼠的B細(xì)胞

參考文獻(xiàn)：David K, Friedlander G, Pellegrino B, et al. CD74 as a regulator of transcription in normal B cells[J]. Cell Reports, 2022.

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：siRNA

電轉(zhuǎn)參數(shù)：275V,3ms。

B淋巴細(xì)胞通過分泌抗體和細(xì)胞因子，并通過其抗原呈遞功能啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在體液免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。CD74是一種II型跨膜蛋白，主要在抗原呈遞細(xì)胞（APC）上表達(dá)，CD74 的配體是巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）細(xì)胞因子超家族，其與CD74 結(jié)合以誘導(dǎo)與CD44 形成復(fù)合物。該受體復(fù)合物對(duì)于啟動(dòng)調(diào)節(jié)B細(xì)胞維持所需的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)至關(guān)重要并涉及PI3K/AKT通路的激活。該復(fù)合物被內(nèi)化到內(nèi)吞區(qū)室，在那里它被切割釋放CD74 細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域片段（CD74-ICD）。CD74-ICD易位至細(xì)胞核誘導(dǎo)核因子κB（NF-κB）的p65激活結(jié)構(gòu)域磷酸化，并與其共激活因子一起上調(diào)TAp63 表達(dá)。該激活通路誘導(dǎo)BCL-2表達(dá)水平升高，并導(dǎo)致控制 B 細(xì)胞增殖和基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在之前的研究中，科學(xué)家已經(jīng)證實(shí)了CD74在慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）細(xì)胞中起著轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用，但在B細(xì)胞中的功能研究還未有過，因此該研究是很有必要的。

為了研究CD74在B細(xì)胞中的功能作者對(duì)來源于人和老鼠的正常B細(xì)胞進(jìn)行RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄、抗CD74抗體活化B細(xì)胞、制備ChIP-seq文庫及其序列分析、沉淀抗體加到細(xì)胞裂解物中進(jìn)行免疫沉淀分析、siRNA電轉(zhuǎn)染B細(xì)胞、流式細(xì)胞染色、模型構(gòu)建及數(shù)據(jù)分析等方法（圖1）。

圖1.CD74在健康與CLL患者的B細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用對(duì)比，揭示了在致癌轉(zhuǎn)化過程中激活或抑制的途徑。

其中在電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過程中，作者使用NEPA21電穿孔儀通過電穿孔人和小鼠的B細(xì)胞引入siRNA（使用的抑制序列包括：人和老鼠細(xì)胞的PAX5；非特異性對(duì)照siRNA；圖2H、圖3A）。

圖2H.用PAX5或?qū)φ誷iRNA電轉(zhuǎn)染純化的健康人B細(xì)胞，通過qRT-PCR分析DMTF1的mRNA水平，圖表顯示了所選基因的倍數(shù)變化。

圖3.CD74以PAX5 依賴性方式調(diào)節(jié) DMTF1轉(zhuǎn)錄(A:用siRNA PAX5或siCtrl轉(zhuǎn)染老鼠B細(xì)胞，培養(yǎng)后，用載體活化細(xì)胞1小時(shí)收集細(xì)胞并進(jìn)ChIP，CD74-ICD與DMTF1基因的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合由qPCR確定.Graph表示輸入富集百分比。

在本研究中，作者研究了CD74-ICD在正常B細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控功能。發(fā)現(xiàn)激活后CD74-ICD在胞質(zhì)溶膠中與轉(zhuǎn)錄因子（如PAX5）形成復(fù)合物，并且與CLL細(xì)胞中的結(jié)合相比，染色質(zhì)在位點(diǎn)數(shù)量明顯增加。這些結(jié)合基因主要部分的表達(dá)在惡性細(xì)胞中被關(guān)閉。CD74-ICD：PAX5復(fù)合物結(jié)合抑癌基因 DMTF1 的啟動(dòng)子區(qū)域，并通過抑制轉(zhuǎn)錄下調(diào)其表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)可以幫助確定在致癌轉(zhuǎn)化過程中受到調(diào)節(jié)的新治療途徑，并成為未來治療的靶點(diǎn)。

總 結(jié)

如今隨著基于細(xì)胞的基因治療分子工具被開發(fā)利用，包括FDA批準(zhǔn)的CAR-T免疫療法、iPSC、細(xì)胞重編程和基因編輯等。盡管這些應(yīng)用取得了很好的結(jié)果，但包括核酸和蛋白質(zhì)在內(nèi)的等外源分子在細(xì)胞內(nèi)的遞送仍然具有挑戰(zhàn)性，因此，以脈沖電場(chǎng)電穿孔細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移具有明顯的處理簡單、高效、高轉(zhuǎn)染、高存活率以及免疫反應(yīng)限制低等優(yōu)勢(shì)，電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)已成為目前最流行的非病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)之一。電轉(zhuǎn)染技術(shù)也在由細(xì)胞的基因功能紊亂或突變所引發(fā)的諸多疾�。ㄈ缑庖呷毕莶�、癌癥、帕金森病、阿爾茨海默病等）研究治療中，通過將質(zhì)粒或相關(guān)基因編輯分子工具引入到細(xì)胞內(nèi)來解讀細(xì)胞功能、指導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)、重編程細(xì)胞行為的重要策略，有望對(duì)細(xì)胞的正常功能恢復(fù)和疾病的治療做出重要貢獻(xiàn)。

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用全新設(shè)計(jì)的電轉(zhuǎn)程序，配合專利的電壓衰減設(shè)計(jì)，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，提高細(xì)胞存活率。操作簡單，電轉(zhuǎn)參數(shù)可見可調(diào)，適用性強(qiáng)。特別適用于難轉(zhuǎn)染的原代免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、外泌體、類器官、活體動(dòng)物、受精卵及宮內(nèi)胚胎等的轉(zhuǎn)染，已應(yīng)用于眾多著名期刊文獻(xiàn)中，是進(jìn)行細(xì)胞懸浮/貼壁狀態(tài)、活體和離體組織轉(zhuǎn)染的電轉(zhuǎn)系統(tǒng)主流品牌之一。

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