水體中微囊藻毒素的ELISA檢測方法

一、概要
   隨著中國水體的富營養(yǎng)化程度逐漸加劇，藍藻水華和赤潮的發(fā)生逐漸增加。80% 的藍藻水華都可以檢測出次生代謝產(chǎn)物---微囊藻毒素（microcystins，MCs），它對水體環(huán)境和人群健康的危害已成為全球關注的重大環(huán)境問題之一。微囊藻毒素為七肽單環(huán)肝毒素，結構中存在著環(huán)狀結構和間隔雙鍵，因而具有相當?shù)姆�(wěn)定性，它能夠強烈抑制蛋白磷酸酶的活性，當細胞破裂或衰老時毒素釋放進入水中，同時它還是強烈的肝臟腫瘤促進劑。MC是一種單環(huán)七肽物質，具有明顯的肝細胞毒性。由于多肽中兩種可變氨基酸組成的不同，具有多種異構體。其中存在最普遍、含量最多的是MC-LR，MC-RR，MC-YR這3種微囊藻毒素。研究表明，MC-LR的急性毒性最強，MC-YR次之，MC-RR最弱。

二、原理
  本試劑盒采用間接競爭法。酶標板微孔中預包被微囊藻毒素抗原，樣品中殘留的微囊藻毒素與微孔板上的抗原競爭微囊藻毒素抗體，加入酶標二抗后，用TMB顯色，吸光值與樣品中微囊藻毒素含量成負相關。

三、試劑盒組成

1. 包被有抗原的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔）
2. 高濃度標準品100ng/mL：1 瓶× 1mL     
3. 標準品工作液：0、0.075、 0.225、 0.675、 2.0ng/mL                1 瓶× 1mL
4. 微囊藻毒素抗體： 1 瓶 × 8mL
5. 酶標二抗：1 瓶 × 15mL
6. 10× 濃縮洗滌液：1 瓶 × 50mL
7. 樣本稀釋液：1 瓶 × 50mL
8. 顯色底物液（TMB）：1 瓶 ×17mL
9. 終止液：1 瓶 × 7mL
10. 試劑盒說明書
11. 質檢報告                                      

四、需要的儀器、試劑
1）儀器   

1. 酶標儀450nm（iELisa全自動酶標儀或相當者）
2. 離心機
3. 微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL
4. 50mL離心管
5. 8道微量移液器
6. 酶標板振蕩器
7. 天平：感量0.01g

五、樣品處理
1. 水樣品---飲用水、地表水

1. 直接吸取50μL澄清樣品用于檢測。

稀釋倍數(shù)：1
2. 海水

1. 吸取100μL澄清樣品與900μL樣本稀釋液，混勻；
2. 直接吸取50μL澄清樣品用于檢測。

稀釋倍數(shù)：5 （由于海水存在基質效應問題，根據(jù)大量的數(shù)據(jù)支撐，稀釋因子由10變更為5）

六、酶聯(lián)免疫分析程序
1. 測定之前注意事項
1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
2) 使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。
3) 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序的要點。
4) 所有孵育過程應避免陽光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標板。
2. 溶液的配制
1) 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋10倍后使用（1份濃縮洗滌液加9份蒸餾水）。
3. 測定程序
1) 將足夠標準品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
2) 分別吸取50μL 標準品和樣品加至相應的微孔（雙孔）中，然后各加入50μL微囊藻毒素抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個標準和樣品必須使用新的吸頭）。
3) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復操作四次，洗板時每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。
4) 加入100μL酶標二抗抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個標準和樣品必須使用新的吸頭）。
5) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復操作四次，洗板時每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。
6) 每孔加入100μL底物， 室溫避光溫育10分鐘。
7) 每孔加入50μL終止液，混勻。
8) 置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值），參比波長630nm。（iELisa全自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。
七、  結果判定
1. 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝	B	×100%
	B0

以微囊藻毒素準品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。
2. 樣品的實際濃度為讀數(shù)結果乘以相應稀釋倍數(shù)。
3. 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一定的比例用稀釋緩沖液進行稀釋。
八、 注意事項
1. 室溫低于20℃或試劑及標本未回到室溫（20- 25℃）會導致數(shù)值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3. 標準物質和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。
4. 混合要均勻，洗板要徹底（包括加樣品和標準液的時候都必需充分混合均勻）。
5. 反應停止液為強酸性物質，避免接觸皮膚。
6. 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣會引起靈敏度降低。
7. 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。
九、檢測方法靈敏度、準確度、精密度
1. 精密度:批內(nèi)變異系數(shù)<10%（n=10），批間變異系數(shù)<25%(n=10)。
2. 靈敏度：0.075ng/mL。
3. 樣本最低檢測線：
飲用水、地表水........................................0.075ng/mL
海水          ..........................................0.75ng/mL
4. 準確度:
飲用水、地表水 .......................................90%±25%
海水 ........................................................ 90%±25%