數字PCR在準確量化定量結直腸癌患者血漿中ctDNA甲基化水平的應用
導讀
基因調控區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)的改變可導致多種癌癥的發(fā)生。這種表觀遺傳學改變在生物學上是穩(wěn)定的，并存在于循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）中，使其適合于早期檢測和無創(chuàng)動態(tài)監(jiān)測腫瘤負荷。數字PCR技術憑借其較高的靈敏度、精度、準確度以及對抑制劑的耐受度，針對低濃度樣本檢測時優(yōu)勢顯著。
文獻解讀：
法國貝桑松大學醫(yī)院腫瘤生物學系的研究者在BMC Cancer（IF：3.8）發(fā)表了題為The detection of specific hypermethylated WIF1 and NPY genes in circulating DNA by crystal digital PCR™ is a powerful new tool for colorectal cancer diagnosis and screening的文章。在轉移性和II/III期結直腸癌（CRC）患者中，WNT inhibitor因子1（WIF1）和神經肽T（NPY）的甲基化程度較高，作者評估是否可以使用WIF1和NPY的甲基化程度作為一種結直腸癌標志物，該研究建立了一種將亞硫酸氫鹽法（bisulfite-將未甲基胞嘧啶轉化為尿嘧啶）與數字PCR相結合的方法。 
文章相關結果： 
A、Naica Crystal Miner分析軟件給出的 3D點圖，用于檢測超甲基化WIF1和NPY和參考基因ALB。
B、通過測量在未甲基化DNA的背景下甲基化DNA的系列稀釋液獲得的標準曲線。為了確定觀察到的突變體數量是否顯著高于LOB，使用了基于假陽性概率的貝葉斯方法。對于每個結果，通過減去最終的假陽性分區(qū)（通過其概率分布加權）來校正陽性分區(qū)的數量。當校正后的95％置信區(qū)間的下限包括零時，該樣本被視為陰性。
3色Naica Crystal Digital PCR檢測WIF1和NPY
分別檢測了10個來自III期或IV期CRC患者和5個健康個體的血漿樣品。來自CRC患者的所有血漿DNA樣本的高甲基化WIF1和NPY得分均為陽性，而在健康個體中未檢測到高甲基化的WIF1和NPY。通過將WIF1和NPY濃度與ALB參考濃度對比評估，血漿DNA中的高甲基化WIF1比例范圍為8％至93％，而高甲基化NPY的比例范圍為0.1％至78％。血漿樣品中檢測到的檢測限甲基化WIF1和NPY量分別為5.1和1.2cp/μL。
通過上述方法，即經亞硫酸氫鹽轉化后再進行3色數字PCR方法，能夠在每25μL體系中可靠的檢測低至25和5個拷貝的高甲基化WIF1和NPY，并且該檢測結果可以用作通用的結直腸癌標志物和腫瘤特異性突變的替代物。使用3色Naica Crystal Digital PCR檢測WIF1和NPY，結果和理論值一致，未出假陰性和假陽性結果。
該研究的結論是使用naica系統(tǒng)檢測結直腸癌（CRC）中特定超甲基化的WIF1和NPY基因可以作為CRC診斷和篩查的強大新工具。研究發(fā)現，與鄰近非腫瘤組織相比，腫瘤組織中的NPY和WIF1基因顯著超甲基化（WIF1的p值<0.001; NPY的p值<0.001）。此外，研究發(fā)現NPY或WIF1在液體活檢中的超甲基化具有95.5%的敏感性[95%CI 77–100%]和100%的特異性[95%CI 69–100%]。研究結果表明，NPY和WIF1的超甲基化是CRC的恒定特異性生物標志物，與它們在致癌過程中的潛在作用無關。
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基因調控區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)的改變可導致多種癌癥的發(fā)生。這種表觀遺傳學改變在生物學上是穩(wěn)定的，并存在于循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）中，使其適合于早期檢測和無創(chuàng)動態(tài)監(jiān)測腫瘤負荷。數字PCR技術憑借其較高的靈敏度、精度、準確度以及對抑制劑的耐受度，針對低濃度樣本檢測時優(yōu)勢顯著。
文獻解讀：
法國貝桑松大學醫(yī)院腫瘤生物學系的研究者在BMC Cancer（IF：3.8）發(fā)表了題為The detection of specific hypermethylated WIF1 and NPY genes in circulating DNA by crystal digital PCR™ is a powerful new tool for colorectal cancer diagnosis and screening的文章。在轉移性和II/III期結直腸癌（CRC）患者中，WNT inhibitor因子1（WIF1）和神經肽T（NPY）的甲基化程度較高，作者評估是否可以使用WIF1和NPY的甲基化程度作為一種結直腸癌標志物，該研究建立了一種將亞硫酸氫鹽法（bisulfite-將未甲基胞嘧啶轉化為尿嘧啶）與數字PCR相結合的方法。
文章相關結果：
▲Bisulfite方法檢測甲基化的原理
A、Naica Crystal Miner分析軟件給出的 3D點圖，用于檢測超甲基化WIF1和NPY和參考基因ALB。
B、通過測量在未甲基化DNA的背景下甲基化DNA的系列稀釋液獲得的標準曲線。為了確定觀察到的突變體數量是否顯著高于LOB，使用了基于假陽性概率的貝葉斯方法。對于每個結果，通過減去最終的假陽性分區(qū)（通過其概率分布加權）來校正陽性分區(qū)的數量。當校正后的95％置信區(qū)間的下限包括零時，該樣本被視為陰性。
3色Naica Crystal Digital PCR檢測WIF1和NPY
分別檢測了10個來自III期或IV期CRC患者和5個健康個體的血漿樣品。來自CRC患者的所有血漿DNA樣本的高甲基化WIF1和NPY得分均為陽性，而在健康個體中未檢測到高甲基化的WIF1和NPY。通過將WIF1和NPY濃度與ALB參考濃度對比評估，血漿DNA中的高甲基化WIF1比例范圍為8％至93％，而高甲基化NPY的比例范圍為0.1％至78％。血漿樣品中檢測到的檢測限甲基化WIF1和NPY量分別為5.1和1.2cp/μL。
※ Concentration of ALB (white bars), hypermethylated WIF1 (black bars) and hypermethylated NPY (hashed bars) in plasma of CRC patients and healthy individuals.
通過上述方法，即經亞硫酸氫鹽轉化后再進行3色數字PCR方法，能夠在每25μL體系中可靠的檢測低至25和5個拷貝的高甲基化WIF1和NPY，并且該檢測結果可以用作通用的結直腸癌標志物和腫瘤特異性突變的替代物。使用3色Naica Crystal Digital PCR檢測WIF1和NPY，結果和理論值一致，未出假陰性和假陽性結果。
該研究的結論是使用naica系統(tǒng)檢測結直腸癌（CRC）中特定超甲基化的WIF1和NPY基因可以作為CRC診斷和篩查的強大新工具。研究發(fā)現，與鄰近非腫瘤組織相比，腫瘤組織中的NPY和WIF1基因顯著超甲基化（WIF1的p值<0.001; NPY的p值<0.001）。此外，研究發(fā)現NPY或WIF1在液體活檢中的超甲基化具有95.5%的敏感性[95%CI 77–100%]和100%的特異性[95%CI 69–100%]。研究結果表明，NPY和WIF1的超甲基化是CRC的恒定特異性生物標志物，與它們在致癌過程中的潛在作用無關。
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